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1、实验一 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材 料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。 同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方 法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提 取植物总DNA的技术。一、实验目的1、学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。2、学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。二、实验原理植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB）,可使核 蛋白体解体，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再
2、用酚、氯仿抽提 纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂, 能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物， 此复合物在高盐（0.7 mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5 mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大局部的蛋白质及多糖 等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇（24:1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等杂 质来纯化DNA,最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀别离出来。三、实验器材、材料和试剂（一）器材1、高压灭菌锅2
3、、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5滤纸6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、离心管（5 ml和2 ml）9、枪头10、移液器11、离心管架12、电子天平（二）材料植物幼嫩叶片（三）试剂1、CTAB缓冲液100 mM Tris （pH8.0）25 mM EDTA （pH8 0）1.5M NaCl2% CTAB2%P-筑基乙醇（使用前现加）2、TE 缓冲液（pH8.0）3、苯酚/氯仿/异戊醇混合液（25： 24： 1, V/V/V）4、/氯仿/异戊醇混合液（24： 1, V/V）4、70%乙醇5、预冷的无水乙醇6、液氮7、RNaseA （10 mg/ml）四、实验步骤1、称取2 g新鲜的植物幼嫩叶片
4、，用蒸储水冲洗叶面，滤纸吸干水分。2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。3、待液氮蒸发完后，加入4 ml预热（65 ）的CTAB提取缓冲液，置于65 水浴保温45 min,不时地轻轻摇动混匀。4、水浴结束后，自然冷却至室温（或冰水浴2 min）,加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，盖上盖子，温和颠倒几分钟，使成乳状液。4下10000 g离心5 min。5、离心管中出现3层，用剪去端部后约0.8 cm的1 mL吸头小心将上层液相转移至一干净的Eppendorf管。6、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上盖子，温和颠倒几分钟，使成乳状液。4 下 10000 g 离心 5 min。7、
5、慢慢加入2倍体积预冷的无水乙醇，边加边用枪头沿同一方向搅动，可 看到纤维状的沉淀(此即为基因组DNA), 12000 g离心5 min。8、去上清，加入1 ml 70%乙醇于离心管中，轻轻摇匀后，7500 g,离心5 min。9、倒去上清后，稍稍离心几十秒，用枪头吸去剩余的乙醇，室温干燥5-10 min。 加入100 1TE缓冲液和2 IRNaseA (10mg/ml), 37保温半小时后, 冻存于-20备用。五、考前须知1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。2、所有操作均需温和，防止剧烈震荡。3、供疏基乙醇是抗氧化剂，不能高压灭菌，必须等其他试剂灭菌冷却后添 加。4、DNA不能过度干燥t脱水，否那么不易溶解。六、思考题1、Trs-CL. EDTA、CTAB、筑基乙醇的作用分别是什么？2、液氮研磨提取基因组DNA的原理是什么？