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1、一、实验原理一、实验原理1、核酸的分类、核酸的分类l DNA DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNADNA，如线粒体如线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA），叶绿体），叶绿体DNADNA（cpDNAcpDNA），质粒），质粒DNADNA。l RNARNA 存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，还有非细胞形式存在的病毒和外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含噬菌体，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARN
2、A。l分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则： 应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。l核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求： 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；浓度的金属离子； 其它生物大分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则一、实验原理一、实验原理l核酸制备时应注意的事项核酸制备时应注意的事项: : 尽量简化操作步骤，缩短提取
3、过程。尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 减少化学因素对核酸的降解。减少化学因素对核酸的降解。 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。 3、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则一、实验原理一、实验原理l核酸制备的步骤：核酸制备的步骤：I. I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中l核酸酶的抑制和抑制剂
4、核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。4、核酸制备的一般方法和原理、核酸制备的一般方法和原理一、实验原理一、实验原理l核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。l核酸酶的
5、抑制和抑制剂 RNase抑制 操作要带手套。 所有器皿要严格消毒， 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 l核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：如：SDSSDS、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、4-4-氨基水杨酸钠、萘氨基水杨酸钠、萘-1.5-1.5-二磺酸钠、二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠三异丙基萘磺酸钠l核酸制备中常用的蛋白质变性剂
6、核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用：蛋白质变性剂的作用： 1. 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2.2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制RNaseRNase活性和破裂细胞的作用。活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPCDEPCl核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 DNaseDNase RNase RNase 蛋白酶蛋白酶K K 溶菌酶
7、溶菌酶 l核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程1 1）破碎细胞）破碎细胞（防止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用） 微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。 高等植物高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物动物：液氮处理后用匀浆器破碎。：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器细胞器DNADNA：首先纯化细胞器。：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂l核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程2
8、2）破碎抽提核酸除去杂质）破碎抽提核酸除去杂质 1 1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离其它成分分离 2 2使核酸与蛋白质分离使核酸与蛋白质分离 3 3除去脂类除去脂类 4 4多糖的除去多糖的除去l核酸提取的一般过程核酸提取的一般过程 3 3）核酸的纯化）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染染, ,并除去提取过程中的系列试剂并除去提取过程中的系列试剂( (盐、有机溶剂盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。等）杂质，最后得到均一的核酸样品。 4 4）核酸样品的保存）核
9、酸样品的保存核酸保存的主要条件是核酸保存的主要条件是温度温度和和介质介质 温度温度： 44（55）最佳和最简单）最佳和最简单 -70-70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20-20保存保存 保存介质保存介质： TETE缓冲溶液缓冲溶液( (最常用最常用) ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0二、材料、设备及试剂二、材料、设备及试剂 菌种菌种 ：DBT降解菌设备设备 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,10
10、00l)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器试剂：试剂：LB液体培养基 、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5M NaCl 、Tris-饱和酚、氯仿、RNA酶A 、无水乙醇 1、1.5ml菌液（每组两管）4 12000rpm离心30sec，弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。2、每管加入400l裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解，37 水浴30min。3、每管加入132l的5M NaCl溶液，颠倒试管，充分混匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪去1ml枪头的尖端）小心取出上清液转倒两支新的eppendorf管中。4、加
11、入等体积的饱和苯酚，充分混匀后，12000rpm离心3min，离心后的水层如混浊则说明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的试管，重复上述步骤直到水层透明，水层和酚层之间不再白色沉淀物为止（约2次）。三、操作步骤三、操作步骤5、将上层清液转入新的eppendorf管，加等体积的氯仿，混匀后13000rpm离心3min，除去苯酚。6、小心吸出上清液转入新的eppendorf管，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置20冰箱30min，然后13000rpm离心15min，可见白色丝状沉淀物。7、小心吸出液体，弃上清液，用预冷的400l 70乙醇洗涤2次，室温干燥后，用50lTE （含20g/ml的Rna
12、se）溶解DNA，20冰箱放置备用。 最好使用新鲜材料，低温保最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组提取血液基因组DNADNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNADNA降解降解 含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量含量较少，提取前先富集较少，提取前先富集 材料应适量，过多会影响裂解，导致材料应适量，过多会影响裂解，导致DNADNA量量少，纯度低少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
13、植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡 采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNADNA时，应提时，应提供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系 采用有机（酚采用有机（酚/ /氯仿）抽提时应充分混匀，但氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应
14、的去杂质的方法应的去杂质的方法 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀会更充分 沉淀时加入沉淀时加入1/101/10体积的体积的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M），有利），有利于充分沉淀于充分沉淀 沉淀后应用沉淀后应用7070的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干晾干DNADNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用若长期储存建议使用TETE缓冲液溶解缓冲液溶解TETE中的中的EDTAEDTA能螯和能螯和MgMg2+2+或或MnMn2+2+离子，抑
15、制离子，抑制DNaseDNasepHpH值为值为8.08.0，可防止，可防止DNADNA发生酸解发生酸解 1. 1.DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有在溶解前，有酒精残留，酒精抑酒精残留，酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属中残留有金属离子离子1. 1.重新纯化重新纯化DNADNA，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等杂质等杂质2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让，让酒精充分挥发酒精充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤乙醇洗涤的次数（的次数（2-32-3次）次）q问题一：问题一：DN
16、ADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。 原原因因对对策策1. 1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1. 1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量
17、丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融q问题二：问题二：DNADNA降解降解对对策策 原原因因1. 1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1. 1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料料2.2
18、.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁或机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PKPK的用量）的用量）4.4.低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒q问题三：问题三：DNADNA提取量少提取量少对对策策 原原因因1 1简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的现象及其成因。现象及其成因。2.2.沉淀时为什么要用无水乙醇？沉淀时为什么要用无水乙醇？基因工程教学网站：基因工程教学网站：http:/210.32.200.206/genehttp:/210.32.200.206/gene