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1、微生物检验微生物检验9 9不发酵革兰阴性杆菌不发酵革兰阴性杆菌n n概念：一大群不发酵葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖的需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌。3.微生物特性n n革兰阴性、无芽胞、专性需氧革兰阴性、无芽胞、专性需氧革兰阴性、无芽胞、专性需氧革兰阴性、无芽胞、专性需氧n n有端鞭毛或丛鞭毛有端鞭毛或丛鞭毛有端鞭毛或丛鞭毛有端鞭毛或丛鞭毛n n生长温度范围广，最适生长温度为生长温度范围广，最适生长温度为生长温度范围广，最适生长温度为生长温度范围广，最适生长温度为3535n n产生各种水溶性色素：绿脓素、脓玉红素、荧光产生各种水溶性色素：绿脓素、脓玉红素、荧光产生各种水溶性色素：绿脓素
2、、脓玉红素、荧光产生各种水溶性色素：绿脓素、脓玉红素、荧光素、脓褐素素、脓褐素素、脓褐素素、脓褐素n n对理化因素耐受性较强，对多种抗生素耐药对理化因素耐受性较强，对多种抗生素耐药对理化因素耐受性较强，对多种抗生素耐药对理化因素耐受性较强，对多种抗生素耐药 4.微生物检验n n检验程序检验程序 n n鉴定鉴定n n药物敏感性试验按药物敏感性试验按NCCLSNCCLS（National National Committee for Clinical Laboratory StandardsCommittee for Clinical Laboratory Standards）推荐，）推荐，分为分
3、为4组：组：A，B，C，D二、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa)n n1.临床意义：铜绿假单胞菌在自然界分布较临床意义：铜绿假单胞菌在自然界分布较为广泛，因此很容易污染器械而造成感染为广泛，因此很容易污染器械而造成感染机会机会n致病机制 粘附素：粘附粘附素：粘附 结构成分结构成分 多糖似荚膜物质多糖似荚膜物质 毒素毒素 内毒素：内毒素：LPSLPS毒力因子毒力因子 外毒素：外毒素：A A 阻止真核细胞蛋白质合成阻止真核细胞蛋白质合成 S S 干扰吞噬杀菌作用干扰吞噬杀菌作用 绿脓素：具有氧化还原活性，催化超氧化物和绿脓素：具有氧化还原活性，催化超氧化物和 过氧化氢产生有毒基团过氧化氢产生
4、有毒基团 酶类酶类 弹性蛋白酶弹性蛋白酶:丝氨酸蛋白酶（丝氨酸蛋白酶（Las-ALas-A）降解弹性降解弹性 锌金属蛋白酶（锌金属蛋白酶（Las-BLas-B）蛋白）蛋白 磷脂酶磷脂酶C:C:分解脂质和卵磷脂，损伤组织细胞分解脂质和卵磷脂，损伤组织细胞2.生物学特性革兰阴性，长短不一革兰阴性，长短不一革兰阴性，长短不一革兰阴性，长短不一单鞭毛单鞭毛单鞭毛单鞭毛生长温度生长温度生长温度生长温度25254242氧化酶阳性氧化酶阳性氧化酶阳性氧化酶阳性还原硝酸盐、分解尿素、还原硝酸盐、分解尿素、还原硝酸盐、分解尿素、还原硝酸盐、分解尿素、精氨酸酶阳性精氨酸酶阳性精氨酸酶阳性精氨酸酶阳性（1）分离培养
5、与鉴定：）分离培养与鉴定：标本可接种于血琼脂平板培养基和选标本可接种于血琼脂平板培养基和选 择性培养基择性培养基 鉴定根据镜下特征、菌落形态、生化鉴定根据镜下特征、菌落形态、生化 反应等反应等3.微生物检验（微生物检验（检验程序检验程序）铜绿假单胞菌（P.aeruginosa)n n血平板上毛玻璃血平板上毛玻璃血平板上毛玻璃血平板上毛玻璃样，金属光泽，样，金属光泽，样，金属光泽，样，金属光泽，生姜味生姜味生姜味生姜味n n可产生多种色素：可产生多种色素：可产生多种色素：可产生多种色素：荧光素与绿脓素荧光素与绿脓素荧光素与绿脓素荧光素与绿脓素铜绿假单胞菌（P.aeruginosa)n n绿脓素绿
6、脓素绿脓素绿脓素铜绿假单胞菌（P.aeruginosa)（2）抗原检测：）抗原检测：血清学分型、噬菌体分型（3）核酸检测：）核酸检测：质粒指纹图分析、脉冲场凝胶电泳分析（PFGE pulsed field gel electrophoresis）、基因芯片、PCR技术、16SrDNA分型鉴定技术铜绿假单胞菌（P.aeruginosa)检验结果分析与报告：检验结果分析与报告：诊断一定要与临床表现相结合诊断一定要与临床表现相结合 治疗过程中，治疗过程中，34天后重复药敏测试天后重复药敏测试耐药机制：耐药机制：耐药机制：耐药机制：产酶：金属酶，产酶：金属酶，产酶：金属酶，产酶：金属酶，OXAOXA酶
7、酶酶酶外膜蛋白的改变（外膜蛋白的改变（外膜蛋白的改变（外膜蛋白的改变（Outer membrane proteinsOuter membrane proteins，OMPOMP）为主要机制为主要机制为主要机制为主要机制主动泵出机制：对喹诺酮类，主动泵出机制：对喹诺酮类，主动泵出机制：对喹诺酮类，主动泵出机制：对喹诺酮类，MexA-MexB-OprMMexA-MexB-OprM及及及及MecC-MexD-OprjMecC-MexD-Oprj整合子：整合子：整合子：整合子：1 1类，类，类，类，3 3类类类类 铜绿假单胞菌（P.aeruginosa)三、马勒伯克霍尔德菌与伪马勒伯克霍尔德菌n n属
8、于属于rRNArRNA第第II II群群n n鼻疽病与类鼻疽病的病原体鼻疽病与类鼻疽病的病原体n n20042004年年NCCLsNCCLs称为可能成为生物恐怖的细菌称为可能成为生物恐怖的细菌马勒伯克霍尔德菌与伪马勒伯克霍尔德菌n n两菌均人兽共患病原菌n n人类感染是经伤口、粘膜、呼吸道n n急性患者可有高热、衰竭等全身症状n n肺鼻疽病、皮肤鼻疽病、内脏脓肿、菌血症、脓毒血症 临床意义临床意义生物学特性 n n革兰阴性杆菌 n n无芽胞、无荚膜n n伪马勒鼻伯克霍尔德菌一端有丛鞭毛(14 根)，4不能生长n n马勒鼻伯克霍尔德菌无鞭毛无动力，42 不生长微生物检验n n分离培养与鉴定分离培
9、养与鉴定 n n需氧菌n n生长温度35n n普通培养基、血琼脂、麦康凯n n生化鉴定n n荧光直接法染色镜检，可快速诊断四、嗜麦芽窄食单胞菌n n属于假单胞菌科的rRNA同源群n n嗜麦芽窄食单胞菌（S.maltophilia）和S.africana分类分类临床意义临床意义 n n为条件致病菌n n呼吸道、泌尿道、伤口等部位感染，菌血症及心内膜炎。n n在不发酵菌引起的感染中，仅次于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，居临床分离阳性率的第三位。生物学特性生物学特性n n革兰阴性，端鞭毛，(18)根n n有动力、无芽孢、无荚膜n n生长温度为35，4不生长n n血琼脂、普通培养基n n菌落中等大小、圆
10、形、光滑、湿润、产生不溶血的黄色色素n n生化鉴定：生化鉴定：氧化酶阴性 液化明胶 水解七叶苷 赖氨酸脱羧酶阳性 氧化分解麦芽糖药物敏感试验及结果解释n n治疗首选磺胺类：治疗首选磺胺类：TMP/SMZTMP/SMZ；喹锘酮类：环丙；喹锘酮类：环丙 氟派酸或替卡西林氟派酸或替卡西林/棒酸棒酸n n泰能泰能(Imipenem)(Imipenem)天然耐药天然耐药n n药敏试验纸片法仅有三种抗生素：左氧氟沙星、药敏试验纸片法仅有三种抗生素：左氧氟沙星、米诺环素、复方磺胺有折点。其他药敏试验应选米诺环素、复方磺胺有折点。其他药敏试验应选用肉汤、琼脂稀释法作用肉汤、琼脂稀释法作MICMIC，或采用，或
11、采用E-TESTE-TEST的方的方法。法。第二节 不动杆菌属 分类：分类：n n醋酸钙不动杆菌醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)n n洛菲不动杆菌洛菲不动杆菌(A.lwoffi)n n溶血不动杆菌溶血不动杆菌(A.haemolgticus)n n鲍曼不动杆菌鲍曼不动杆菌(A.baumannii)n n琼氏不动杆菌琼氏不动杆菌(A.junii)n n约翰逊不动杆菌约翰逊不动杆菌(A.johnsonii)临床意义n n为条件致病菌n n在不发酵菌的感染中仅次于假单胞菌，近年呈上升趋势生物学特性n n革兰阴性杆菌，多为球杆革兰阴性杆菌，多为球杆 状，常见成对排列状，常见成对排列n n
12、无芽胞，无鞭毛无芽胞，无鞭毛n n专性需氧菌专性需氧菌n n生长温度为生长温度为3535n n普通培养基，麦康凯、血普通培养基，麦康凯、血平板均生长平板均生长n n氧化酶阴性，动力阴性，氧化酶阴性，动力阴性，硝酸盐试验阴性硝酸盐试验阴性微生物检验（微生物检验（检验程序检验程序）n n血琼脂培养基：菌落血琼脂培养基：菌落圆形、灰白色、光滑、圆形、灰白色、光滑、边缘整齐、直径边缘整齐、直径23mm23mmn n而洛菲不动杆菌菌落而洛菲不动杆菌菌落小，直径为小，直径为11.5mm11.5mm药物敏感试验及结果解释n nKirby-Bauer法做药敏试验，药物的选择与假单胞菌抗生素的分组相同n n鲍曼
13、氏不动杆菌，对全部氨基青霉素、一代二代头孢菌素和一代喹诺酮类抗生素天然耐药第三节 产碱杆菌属n n粪产碱杆菌粪产碱杆菌(A.faecalisA.faecalis)n n皮乔特产碱杆菌皮乔特产碱杆菌(A.PiechaudiiA.Piechaudii)n n粪产碱杆菌亚型粪产碱杆菌亚型(A.faecalis typeA.faecalis type)n n木糖氧化产碱杆菌木糖氧化产碱杆菌(A.xylosoxidansA.xylosoxidans)n n脱硝亚种脱硝亚种(Subsp(Subsp.denitrificans)denitrificans)n n木糖氧化亚种木糖氧化亚种(Subsp(Subs
14、p xylosoxidans)xylosoxidans)分类分类临床意义n n人体的正常菌群n n医院感染的病原菌之一产碱杆菌属产碱杆菌属生物学特性n n革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌n n周鞭毛、有动力周鞭毛、有动力n n最适生长温度为最适生长温度为 2535 2535n n普通培养基生长普通培养基生长分离培养与鉴定n npHpH至至8.68.6为本菌特点为本菌特点n n氧化酶阳性氧化酶阳性n n触酶阳性触酶阳性n n不分解任何糖类不分解任何糖类n n O-F O-F基础培养呈碱性基础培养呈碱性n n脲素酶阴性脲素酶阴性n n不液化明胶不液化明胶第四节 黄杆菌属n n短黄杆菌短黄杆菌 (F F.b
15、reve).breve)n n脑膜炎败血性黄杆菌脑膜炎败血性黄杆菌 (F(F.meningospticum).meningospticum)n n芳香黄杆菌芳香黄杆菌 (F.odoratum)(F.odoratum)n n水田黄杆菌水田黄杆菌 (F F.mizutaii).mizutaii)n n嗜糖黄杆菌嗜糖黄杆菌 (F.F.multrivorum)multrivorum)n n嗜醇黄杆菌嗜醇黄杆菌 (F.F.spiritivorum)spiritivorum)n n嗜温黄杆菌嗜温黄杆菌 (F F.thalpophilum).thalpophilum)n n薮内黄杆菌薮内黄杆菌 (F F.g
16、aduuchiae).gaduuchiae)n nIIbIIb群黄杆菌群黄杆菌 (F F.group IIb).group IIb)n nIIeIIe群黄杆菌群黄杆菌 (F.F.group IIe)group IIe)n nIIhIIh群黄杆菌群黄杆菌 (F.F.group IIh)group IIh)n nIIiIIi群黄杆菌群黄杆菌 (F.F.group IIi)group IIi)分类分类临床意义临床意义n n是条件致病菌n n医院感染的常见菌之一n n引起败血症、新生儿及婴幼儿的化脓性脑膜炎生物学特性n n革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌n n无鞭毛、无动力、无鞭毛、无动力、无荚膜、无芽胞无荚
17、膜、无芽胞n n需氧代谢需氧代谢n n氧化酶、触酶、磷酸氧化酶、触酶、磷酸酶阳性酶阳性分离培养与鉴定n n血琼脂培养基血琼脂培养基n n生长温度为生长温度为3535n n菌落：光滑、有光菌落：光滑、有光泽、边缘整齐，淡泽、边缘整齐，淡黄色，也有的呈黄黄色，也有的呈黄色或棕黄色色或棕黄色药物敏感试验及结果解释n n 临床经验用药可选磺胺及大环内脂类的红 霉素。n n 临床上常见的脑膜炎败血黄杆菌及芳香黄 杆菌等对广谱抗菌药有耐药性，所以最好 根据药敏试验选择用药。第五节 莫拉菌属分类n n莫拉菌属莫拉菌属(Moraxella)Moraxella)属莫拉菌科（属莫拉菌科（Moraxellaceae
18、Moraxellaceae）n n医学上重要的莫拉菌有：医学上重要的莫拉菌有：n n腔隙莫拉菌（腔隙莫拉菌（M.lacunataM.lacunata）n n卡他莫拉菌（卡他莫拉菌（M.catarrhalisM.catarrhalis）n n非液化莫拉菌非液化莫拉菌(M.nonliquefaciensM.nonliquefaciens)n n奥斯陆莫拉菌奥斯陆莫拉菌(M.osloensisM.osloensis)n n亚特兰大莫拉菌亚特兰大莫拉菌(M.atlantaeM.atlantae)n n狗莫拉菌狗莫拉菌(M.canisM.canis)n n林肯莫拉菌林肯莫拉菌(M.lincolniiM.
19、lincolnii)临床意义n n引起眼结膜炎、气管炎、肺炎、脑膜炎、脑脓肿、心包炎、心内膜炎及泌尿生殖系统炎症微生物特性n n革兰阴性球杆菌革兰阴性球杆菌n n呈双短链状排列，呈双短链状排列，具有多形性具有多形性微生物检验 分离培养：分离培养：分离培养：分离培养：n n营养要求较高营养要求较高n n生长温度生长温度32353235n n血琼脂平板上生长良好血琼脂平板上生长良好n n针尖大小的圆形凸起、针尖大小的圆形凸起、光滑、半透明、边缘整光滑、半透明、边缘整齐不溶血的菌落。齐不溶血的菌落。微生物检验鉴定：鉴定：n n氧化酶阳性n n触酶阳性n n无动力n n不分解任何糖类n n吲哚试验阴性
20、药物敏感试验及结果解释n n对青霉素类敏感n n对头孢类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖 甙类药物均为敏感n n脑炎或脑膜炎、脑脓肿应注意药物通过血 脑屏障的问题第六节 军团菌属分类n n军团菌属军团菌属(LegionellaLegionella)属于军团菌科属于军团菌科（LegionellaceaeLegionellaceae）n n常见的与人类疾病有关的军团菌：常见的与人类疾病有关的军团菌：n n嗜肺军团菌（嗜肺军团菌（Legionella pneumophilaLegionella pneumophila）n n米克戴德军团菌（米克戴德军团菌（L.micdadeiL.micdadei）n n
21、长滩军团菌（长滩军团菌（L.longbeachaeL.longbeachae）n n杜莫夫军团菌（杜莫夫军团菌（L.dumoffiiL.dumoffii）n n波兹曼军团菌（波兹曼军团菌（L.bozemaniiL.bozemanii）临床意义n n引起肺炎型和非肺炎型引起肺炎型和非肺炎型(庞蒂亚克热庞蒂亚克热Pontiac fever)Pontiac fever)感染感染n n肺炎型：多器官损害，肺部、消化道及神经系统症肺炎型：多器官损害，肺部、消化道及神经系统症 状及体征，致死率高状及体征，致死率高n n医院感染可高达医院感染可高达23%23%n n慢性心、肺、肾病变、艾滋病或接受免疫抑制剂
22、者慢性心、肺、肾病变、艾滋病或接受免疫抑制剂者 易发本病，且死亡率高达易发本病，且死亡率高达45%45%临床意义 空气乳胶微粒传播 发病机制：内毒素和细胞产生的多种酶 裂解红细胞 消化卵黄囊生物学特性n n革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌n n菌体呈线状菌体呈线状n n无芽胞，无荚膜，有端无芽胞，无荚膜，有端 鞭毛或侧鞭毛鞭毛或侧鞭毛n n严格需氧严格需氧n n触酶阳性触酶阳性n n可液化明胶可液化明胶n n不分解糖类不分解糖类n n部份菌株氧化酶阳性部份菌株氧化酶阳性微生物检验n n临床标本：痰、气管分泌物、胸水和血液为主。n n病理组织标本：必须制成悬液，再进行涂片和分离培养。n n环境污染标本：
23、应先浓缩再接种。微生物检验 分离培养：分离培养：分离培养：分离培养：n n营养要求苛刻，生长缓慢营养要求苛刻，生长缓慢n n生长温度为生长温度为3535n n最适最适pH6.77.0pH6.77.0n n初次分离必须采用初次分离必须采用(BCYE)(BCYE)n n3535天可形成天可形成12mm12mm直径直径的光泽菌落的光泽菌落n n核酸检测核酸检测：是快速特异的方法，采用DNA探针及PCR扩增rRNA的方法均可用于军团菌的快速诊断n n抗体检测：是抗体检测：是检测军团菌感染临床常用手段，常采用方法：IFA、MAA、TAT、ELISA法等军军 团团 菌菌 感感 染染 诊诊 断断 试试 验验
24、试验试验敏感性敏感性(%)(%)特异性特异性(%)(%)评评注注培养培养7070100100参考方法参考方法直接免疫直接免疫荧荧光光252570709595不推荐常不推荐常规应规应用用间间接免疫接免疫荧荧光光707090909999只用于嗜肺只用于嗜肺军团军团菌血清群菌血清群1 1酶酶标记标记免疫免疫707090909999乳胶凝集乳胶凝集5555909085859999血清学（血清学（间间接免接免疫疫荧荧光）光）707080809595辅辅助培养助培养 非发酵菌非发酵菌嗜麦芽窄食单胞菌嗜麦芽窄食单胞菌葡萄糖产酸葡萄糖产酸无色杆菌属无色杆菌属土壤杆菌属土壤杆菌属假单胞菌属假单胞菌属动力动力+OXOX不动杆菌属不动杆菌属+葡萄糖产酸葡萄糖产酸黄色素黄色素摩拉氏菌属摩拉氏菌属黄杆菌属黄杆菌属+端鞭毛端鞭毛+产碱杆菌属产碱杆菌属尿素尿素+常见不发酵菌的鉴定双岐索引常见不发酵菌的鉴定双岐索引结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！64