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1、微生物限度检验微生物限度检验微生物限度检查(Microbial Limits Test)：是指非无菌制剂及原，辅料受到微生物污染程度的检查。包括：1）细菌计数；2）霉菌及酵母菌计数；3）控制菌检查：大肠杆菌，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，大肠菌群2验证目的确认一种检验方法。验证实验 检验条件 检验方法 样品量样品量稀释液种类稀释液种类稀释液体积稀释液体积中和剂中和剂培养基培养基培养时间培养时间培养温度培养温度SOP检验规程检验规程9影响微生物检验的因素-样品/药品自身的特殊性-样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂-培养基的特性-培养条件-人员因素-实验器材的选择 10恢复试验-微生物方法验
2、证的实质就是评价和考察微生物恢复试验（恢复生长）的可信度。-恢复试验就是确认某一检验方法，它可以使加入其中的各种微生物都能够恢复生长。11验证内容（一）计数方法验证（二）控制菌检验方法验证12微生物限度检验方法验证（一）计数方法验证13 供试液制备（中国药典2005版）-表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。-供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。-供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。-供试液的体积：100ml。14稀释剂（中国药典2005版）（1）pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（2）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（3）pH7.6无菌磷酸盐缓
3、冲液 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml15微生物计数方法验证菌种选择原则普遍性 -G+、G-、-杆菌（长、短杆菌）-球菌 -真菌（丝状真菌、酵母菌）特殊性 -从环境中分离出来的常见杂菌 -从样品中分离出来的常见杂菌16微生物计数方法验证用菌株：中国药典2005版菌株名称 CMCC编号 培养条件 大肠埃希氏菌(E.coli)CMCC(B)44102 金黄色葡萄球菌(Sta.aureus)CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌（Bac.subtilis）CMCC(B)63501 白色念珠菌(Can.albicans)CMCC(F)98001 黑曲霉
4、菌(Asp.niger)CMCC(F)98003营养肉汤培养基 30-35 18-24h改良马丁培养基 20-25 18-24h改良马丁斜面培养基 20-25 5-7天17微生物计数方法验证用菌株：USP29版 菌株名称 ATCC编号 培养条件 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC 8739 32+2.5 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538 32+2.5 铜绿假单胞菌(Staphylococcus aureus)ATCC9027 32+2.5 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC11437 32+2.5
5、 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633 22+2.5 白色年珠菌(Candida albicans)ATCC10231 22+2.5 黑曲霉菌(Candida albicans)ATCC16404 22+2.518计数方法验证步骤选定一个方法 确定检测限设计验证方案19样品的选择：合格的样品 -按照正常取样方法取样的样品 -符合限度标准的样品 20检测限：样品中细菌被检出的最低量。细菌 100 cfu/ml 霉菌、酵母菌 100 cfu/ml21恢复试验的原则-消除样品的抑菌性-样品的处理方法和检验方法不应影响样品中微生物的生长 22如何消抑菌活性-稀释法-中和法
6、-离心法-薄膜过滤法-组合运用23计数方法验证（平板法）样品组：样品溶液（1/10）9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml稀释剂对照组：蛋白胨稀释液 9.9ml （阴性对照）104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 菌种组：104 102 （阳性对照）空白样品组：计数A计数B计数C计数D24结果判断依据：1、样品组和稀释剂对照组微生物计数结果吻合，表明：-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。2、稀释剂对照组和菌种组微生物计数结果吻合，表明：-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。3、空白样品组测试结果阴性，表明：-本次测试样品合格。-无菌操
7、作正确。没有污染事件发生。25可以接受的标准 平板法1、重现性良好 -三批不同批次的样品/产品 -三次独立的试验2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：无污染事件发生 -样品组（回收率）：A=C 30%（偏差 30%）3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符26计数方法的验证-各国药典结果判断标准USP：各试验菌的回收率均不低于70%。EP、BP、JP:各试验菌的回收率均不低于80%。2005版中国药典：各试验菌的回收率（包括供试品组和稀释剂对照组）均不低于70%。27不可以接受的标准：1、阴性对照：阴性对照(包括蛋白胨组和空白样品组)发生污染事件。菌落鉴别：-污染菌是测试菌：检验
8、员无菌操作培训。-污染菌不是测试菌：偏差调查。2、阳性对照：样品组的试验数据与检测限不符。（微生物的回收率过 高或过低）结论：样品组的试验结果无效。重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。28不可以接受的标准：3、样品组：-三人三次的试验结果应该与检测限相符。-第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的试验证实。-任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程有缺陷，验证需重新进行。29优化更新步骤：消除抑菌活性。稀释样品时，应确认检测限（检验限度）低于或等于标准。不同的细菌，一个好的结果可以从不同的稀释度中检测出，最高的稀释度将被用于日常的监测中。30平板法优化更新方法：稀释样品：1/10 1/50
9、 1/100 增加培养基量延长培养时间添加抗活性剂31计数方法验证（薄膜过滤法）样品组：样品溶液（1/10）10ml 过滤 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml蛋白胨对照组：蛋白胨稀释液 10ml 过滤 （阴性对照）5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 菌种组：5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 过滤 （阳性对照）空白样品组：过滤 计数A计数B计数D计数C32可以接受的标准 薄膜过滤法1、重现性良好 -三批不同批次的样品/产品 -三次独立的试验2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：没有污染事件发生。-样品组：B=A+30%（偏差 30%）3、样品的处理方法
10、和检验方法与检验规程相符33薄膜过滤法优化更新方法：增加冲洗量 增大样品稀释倍数（1/50，1/100）延长培养时间添加抗活性剂（冲洗剂里加也可以）34微生物检验方法验证（二）控制菌检验方法验证35控制菌检验方法验证菌种选择原则样品的给药途径和类型决定了采用何种控制菌检查验证。36增菌培养基的确定增菌培养基的实际用量等同控制菌检查方法验证时的用量。验证的开始。37控制菌检验方法验证选定一个方法：CP或USP 设定检测限：不得检出设计验证方案38控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）增菌 （计数）样品组蛋白胨对照菌悬液对照样品100ml增菌液大肠杆菌悬液0.1ml、1X102 cfu/m
11、l大肠杆菌悬液 0.1ml、1X102 cfu/ml 蛋白胨100ml 增菌液 大肠杆菌悬液0.1ml、1X102 cfu/ml 培 养样品组空白样品对照39控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）确认培养结束后，需检查大肠杆菌菌落形态并镜检，必要时要鉴别。4 组测试样品观察CP法USP法18小时24小时40结果判断依据：1、样品组和蛋白胨对照组测试结果一致，表明：-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。2、蛋白胨对照组和菌种组测试结果一致，表明：-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。3、空白样品组测试结果阴性，表明：-本次测试样品合格。-无菌操作
12、正确。没有污染事件发生。41可以接受的标准1、样品检验 -增菌液经培养后明显浑浊 -分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落2、阳性对照 -增菌液经培养后必须是浑浊的 -分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落3、阳性菌计数 -菌悬液的计数结果应该 100 cfu42不可以接受的标准（无效试验）1、样品检验 -与可接受的标准不符 结论：重新设计试验步骤2、阳性对照 -与可接受的标准不符 结论：重新试验3、阳性菌计数 -与标准不符 结论：重新开设大肠杆菌的恢复试验，制作新的菌悬液直到符合规定。43优化控制菌验证步骤：扩大增菌液的体积 100ml 200ml 300ml 400ml 500ml延长增菌液的培养时间
13、采用薄膜过滤法加入活性试剂44控制菌检验方法验证（薄膜过滤法）（以大肠杆菌为例）加10ml 稀释液到薄膜过滤器中，加湿过滤器。加100ml 样品增菌液到薄膜过滤器中。加0.1ml、5X102 cfu/ml大肠杆菌悬液到薄膜过滤器中并用稀释液冲洗，这样，薄膜上就应该有50 cfu个菌落出现。45失败的验证（无效试验）1、样品中有些成分是固有的抑菌成分2、参考防腐剂的实验/验证数据3、参考样品中各成分的理化性质 46验证结果根据验证结果，判断是否符合验证的标准。符合 按验证的方法和条件继续进行药品的微生物限度检查；不符合 重新设计验证方案，再进行验证，直至验证结果全部符合验证方案。47验证报告的形
14、成1、全部验证工作必须按照批准的验证方 案进行。2、验证方案批准后，可以进一步再修订，但必须在验证报告上注明。3、验证结束后，应该同时出具验证数据 记录和验证报告。4、最终样品稀释度及方法必须在SOP中 说明。48采用薄膜过滤法的供试品 （1）水溶液 （2）可溶于水的固体制剂 （3）-内酰胺类抗生素 非水溶性制剂 （1）可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂 （2）无菌气（喷）雾剂 装有药物的注射器 （3）具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)49方法验证的关键点（1）对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的实验人员的测定结果的可能有很大的误差，甚至达到50%。所以，在操作过程中，应特别注意能
15、造成误差的各个环节。50方法验证的关键点（2）当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体充分分散于稀释液中，一般将菌苔与微量稀释液先在管壁上混匀。对于那些不易制成均匀菌悬液的菌苔（如枯草芽孢杆菌），一般采用液体培养物制备菌悬液。若液体培养物产生菌膜，取菌液时应避免取出菌膜，一般应取培养管中部的均匀菌悬液。51方法验证的关键点（3）为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍梯度稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。操作时，将灭菌吸管插入原液中，将菌液充分混匀，吸取菌液，贴于试管内壁调整液量至刻度，将菌液移入下一级的稀释管中，移入时，吸管应接触试管内壁并靠近液面（勿接触液面），缓慢地沿管壁放出全部菌液，然后，将吸管放入消毒液中。再取一支灭菌吸管同法往下稀释。52实实例例(摘自中摘自中检检所抗生素工作网站）所抗生素工作网站）头孢羟氨苄片微生物限度检查法头孢羟氨苄片微生物限度检查法双黄连口服液微生物限度检查法双黄连口服液微生物限度检查法53谢谢！54结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！55