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1、基因工程载体ppt课件 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一一 分类分类依功能：依功能：克隆载体、表达载体、转录载体克隆载体、表达载体、转录载体克隆、表达的基本流程：克隆、表达的基本流程：克隆载体克隆载体 转录载体转录载体DNA DNA RNA DNA DNA RNA 蛋白质蛋白质 表达载体表达载体依组成：依组成：质粒、噬菌体、病毒、粘性载体、质粒、噬菌体、病毒、粘性载体、人工染色体人工染色体可承载基因量：可承载基因量：依次增大依次增大依类型：依类型：
2、原核载体：原核载体：质粒、噬菌体质粒、噬菌体真核载体：真核载体：酵母、病毒酵母、病毒两类载体两类载体分泌型载体：分泌型载体：传导入受体细胞后，表达产生传导入受体细胞后，表达产生 蛋白产物释放出来的载体蛋白产物释放出来的载体穿梭载体：穿梭载体：传导入受体细胞后，可在各细胞传导入受体细胞后，可在各细胞 间传递的载体间传递的载体二二 要求要求可独立复制：可独立复制：有复制子有复制子含多个酶切位点：含多个酶切位点：利于双酶切利于双酶切含抗性标记基因：含抗性标记基因：利于重组体筛选利于重组体筛选质量数小：质量数小：可接合外源可接合外源DNADNA的量大的量大三三 结构组成结构组成复制区：复制区：一个载体
3、就是一个复制子一个载体就是一个复制子启动子：启动子：基因可表达基因可表达标志基因（标志基因（例如抗药基因例如抗药基因）：）：标志基因的作用：标志基因的作用：四四 质粒载体质粒载体结构：结构：cccDNAcccDNA（闭合、环状、共价闭合、环状、共价）分类：分类：根据复制类型根据复制类型严紧型：严紧型：一个细菌中不能有过多的该种质粒一个细菌中不能有过多的该种质粒松弛型：松弛型：一个细菌中可有多个该种质粒一个细菌中可有多个该种质粒（2020个个）根据移动性（根据移动性（接合性接合性）转移型（转移型（接合型接合型）：）：可通过性菌毛进入另一细菌可通过性菌毛进入另一细菌非转移型（非转移型（非接合型非接
4、合型）：）：不可通过性菌毛进入另一不可通过性菌毛进入另一 细菌细菌根据作用根据作用F F质粒：质粒：R R质粒：质粒：ColCol质粒：质粒：命名：命名：PBR322PBR322为例为例P P：质粒质粒BRBR：发现、构建该质粒的实验室发现、构建该质粒的实验室/作者名首字作者名首字 母简写母简写322322：该质粒的实验编号该质粒的实验编号特征：特征：一个质粒就是一个复制子一个质粒就是一个复制子不相容性：不相容性：有相同复制起点和分配区的质有相同复制起点和分配区的质 粒不能共存于一个宿主细胞中粒不能共存于一个宿主细胞中几种常见的质粒载体几种常见的质粒载体PBR322PBR322：PUC18/1
5、9PUC18/19：PGEM-3ZPGEM-3Z：PGEM-4ZPGEM-4Z：标志基因的应用标志基因的应用双酶切双酶切方法：方法：用两种不同的内切酶分别切目的片段用两种不同的内切酶分别切目的片段 与载体，各自得到两个不同的黏性末与载体，各自得到两个不同的黏性末 端端作用：作用：目的片段可按顺序接合到载体上，单目的片段可按顺序接合到载体上，单 酶切的载体两边是两个相同的黏性末酶切的载体两边是两个相同的黏性末 端，目的片段结合到载体上的顺序不端，目的片段结合到载体上的顺序不 确定确定抗性筛选抗性筛选插入失活：插入失活：目的基因插入载体时，插入到载目的基因插入载体时，插入到载 体的标记基因当中，破
6、坏了该基体的标记基因当中，破坏了该基 因，使此载体失去对应的抗性因，使此载体失去对应的抗性应避免插入失活的原因：应避免插入失活的原因：不插入失活时，培不插入失活时，培养的细胞菌落培养基中加入一种抗生素（载养的细胞菌落培养基中加入一种抗生素（载体上有对应抗性基因），能继续生长的菌落体上有对应抗性基因），能继续生长的菌落为阳性克隆，即我们要的菌落为阳性克隆，即我们要的菌落插入失活后的筛选：插入失活后的筛选：影印法培养细胞（影印法培养细胞（A A、B B两个培养基中菌落位置分别相等），两个培养基中菌落位置分别相等），A A中中加入加入A A抗生素，抗生素，B B中加入中加入B B抗生素抗生素筛选出有
7、筛选出有A A、B B两抗性基因，但两抗性基因，但A A被插入失活的被插入失活的重组载体：重组载体：A A中的且中的且B B中不死的菌落为阳性克中不死的菌落为阳性克 隆，即我们隆，即我们要的菌落要的菌落蓝白斑筛选蓝白斑筛选原理：原理：IPTGIPTG诱导诱导LacZLacZ（乳糖操纵子中）表（乳糖操纵子中）表 达出的酶可与达出的酶可与X-galX-gal成蓝色吲哚产物成蓝色吲哚产物互补：互补：载体上有载体上有片段，菌体基因组中有片段，菌体基因组中有LacZLacZ（LacZLacZ缺缺片段），阳性克隆菌便有片段），阳性克隆菌便有完整完整LacZLacZ，可加，可加IPTGIPTG诱导产生酶，加诱导产生酶，加X-galX-gal成蓝色吲哚产物蓝斑，阴性克隆菌成白斑成蓝色吲哚产物蓝斑，阴性克隆菌成白斑五五 噬菌体载体噬菌体载体噬菌体载体：噬菌体载体：M130M130噬菌体载体：噬菌体载体：六六 黏性载体黏性载体 七七 病毒载体病毒载体八八 人工染色体人工染色体细菌人工染色体：细菌人工染色体：酵母人工染色体酵母人工染色体本章总结本章总结