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1、第四章第四章 基因工程载体基因工程载体作为一个理想的载体，应具备以下条件：作为一个理想的载体，应具备以下条件：载体：载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的转录功能的 DNA 大分子称之为载体（大分子称之为载体（vector）。）。（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；制子和启动子，使插入基因复制和表达；（2）具具有有多多种种限限制制性性内内切切酶酶的的切切点点，且且切切点点是是单单一一的的，这样可将多个外源这样可将多个外源 DNA 片段插入其中；片段插
2、入其中；（3）具有容易检测的筛选标记；）具有容易检测的筛选标记；（4）载载体体 DNA 的的分分子子量量适适当当，可可容容纳纳较较大大的的外外源源DNA 片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；（5）在在细细胞胞内内稳稳定定性性高高，这这样样可可以以使使重重组组体体可可以以稳稳定定传代而不易丢失。传代而不易丢失。第一节第一节 微生物基因工程载体微生物基因工程载体克隆载体（克隆载体（clone vector）：主要是对目的基因克隆，）：主要是对目的基因克隆，建立建立DNA文库和文库和 cDNA 文库，其上有复制子即可；文库，其上有复制子即可；表表达达载载体体（
3、expression vector）：能能使使目目的的基基因因在在宿宿主主细细胞胞中中表表达达的的一一类类载载体体。这这类类载载体体既既有有复复制制子子，更要有强启动子；更要有强启动子；穿穿梭梭载载体体（shottle vector）：这这类类载载体体可可以以在在原原核核细细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。一、质粒载体一、质粒载体1.严紧型和松驰型质粒严紧型和松驰型质粒严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有有 1 13 3个。个。松驰型质粒：其拷贝数较多，一般松驰型质粒：其拷贝数较多，一般 20 2
4、060 60 个，多个，多的可达的可达 200 200300 300 个。个。2 2、转移型和非转移型质粒、转移型和非转移型质粒转移型，结合型（转移型，结合型（conjugative plasmid）：是指一）：是指一些质粒在不同的菌株中可以相互转移。些质粒在不同的菌株中可以相互转移。非转移型质粒非转移型质粒(non-conjugative plasmid)：则只能则只能在一种寄主中生存在一种寄主中生存。3.质粒的不相容性和不亲和群质粒的不相容性和不亲和群质粒的不相容性：一般地，不同质粒不能共处在质粒的不相容性：一般地，不同质粒不能共处在一个细胞中，这种特性称质粒的不相容性，当它一个细胞中，这
5、种特性称质粒的不相容性，当它们处在一起时，便有生存竞争，结果一种质粒繁们处在一起时，便有生存竞争，结果一种质粒繁殖，另一种逐渐被排斥，数目变少。殖，另一种逐渐被排斥，数目变少。不亲和群：彼此不相容的质粒组成一个不亲合群。不亲和群：彼此不相容的质粒组成一个不亲合群。（二）质粒的命名（二）质粒的命名1.人工组建的质粒人工组建的质粒 人人工工组组建建的的质质粒粒的的第第一一个个字字母母是是质质粒粒英英文文名名字字（plasmid）的的第第一一个个字字符符 p，用用小小写写。p后后有有2个个字字母母是是大大写写，表表示示质质粒粒的的作作者者和和实实验验室室名名称称，再再其其后后为为质粒的编号。质粒的编
6、号。例：例：pXYp109；pSC101等等 天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起来。如（用括号括起来。如（ColE1）；农杆菌质粒用）；农杆菌质粒用p加加Ti（Tumer inducing）或）或At（Agrobacterium tumefacions）表示，如）表示，如 pTiC58。2.2.天然载体质粒天然载体质粒（三）常用质粒载体（三）常用质粒载体 1.pSC101 图2.pBR3222.pBR322（1）组成）组成它由三部分组成：它由三部分组成：来自来自 pSCl01 的四环的四环 素抗性基因素抗性基因 Tetr来自来自 ColE
7、l 的衍生物的衍生物 pMBl 的松弛复制起的松弛复制起点点 ori来自来自RSF2124的氨苄的氨苄青霉素抗性基因青霉素抗性基因Ampr。（2 2）特点）特点具有多个单一的限制性内切酶位点。具有多个单一的限制性内切酶位点。Tetr 中有中有BamH1切点（切点（GGATCC）和）和Sal切点切点（GAATTC），），Ampr 中有中有 Pst切点切点（CTGCAG）。）。利用利用 ColEl 的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。（3）重组克隆的重组克隆的“插入失活插入失活”筛选方法筛选方法
8、pBR322外外源源基基因因插插入入在在 Tetr中中，基基因因型型为为Tets、Ampr在在含含有有氨氨卞卞青青霉霉素素培培养养基基上上可可生生长长，在在含含有四环素培养基上不生长；有四环素培养基上不生长；pBR322外外源源基基因因插插入入在在Ampr中中，基基因因型型为为Tetr、Amps、在在含含有有氨氨卞卞青青霉霉素素培培养养基基上上不不生生长长，在在含有四环素培养基可生长；在在含有四环素培养基可生长；而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源这种在一个基因位点中插入外源 DNA 片段，从而使片段，从而使该基因活性
9、丧失的现象叫该基因活性丧失的现象叫插入失活插入失活。Amp rTet rTet rAmp sPstI.涂布有涂布有Tet的培养基的培养基涂布有涂布有Amp的培养基的培养基.重组体的筛选重组体的筛选外源基因的插入：外源基因的插入：.3、pUC系列质粒载体系列质粒载体（1）特点）特点具有更小的分具有更小的分子量子量（2686bp）和）和更高的拷贝数。更高的拷贝数。具有多克隆位点具有多克隆位点可用组化方法鉴别：可用组化方法鉴别：可通过插入失活法进行筛选可通过插入失活法进行筛选 含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因基因（LacZ），它编码），它编码-半乳糖苷
10、酶氨基端半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸个氨基酸，可以和可以和-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，即即互补互补 ，恢复分解乳糖的能力。，恢复分解乳糖的能力。X-gal也是也是-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无-半乳糖苷半乳糖苷酶时，酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。不被分解，菌落呈白色。当外源基因插入到当外源基因插入到pUC质粒的质粒的LacZ基因内部，则基因内部，则LacZLacZ基因受到破坏，便基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体
11、菌中生成有活性的不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。含含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。选。lacZlacZN端端 C端端缺陷型大肠杆菌缺陷型大肠杆菌完整的完整的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（四）大肠杆菌中的表达载体（四）大肠杆菌中的表达载体表达载体应含有：表达载体应含有：（1）强启动子）强启动子（2）在启动子下游区和）在启动子下游区和 ATG 上游区有一个好的上游区有一个好的SD序列。序列。（3）在外源基因插入序列下游区
12、要有一个强的转）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。定性。二、二、噬菌体载体噬菌体载体（一）（一）噬菌体载体噬菌体载体 1、噬菌体载体的特征噬菌体载体的特征 噬菌体颗粒中噬菌体颗粒中DNA为线状双链为线状双链 DNA 分子，分子，全长全长 48502 bp，两端各有一段长度为，两端各有一段长度为 12 个核苷个核苷酸的互补单链（粘端），称为酸的互补单链（粘端），称为 cos 位点。位点。噬菌噬菌体有体有 61 61 个基因，其中有个基因，其中有 1/3 1/3 的区域是其裂解性的区域是其裂解性生长的非必
13、需区，这一区段的缺失，或在此区段生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源中插入外源 DNA DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就，并不影响噬菌体的增殖，这就是是噬菌体可作为基因载体的依据噬菌体可作为基因载体的依据 。GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG环化作用环化作用2、噬菌体的缺陷与改造噬菌体的缺陷与改造 基因组太大（基因组太大（49kb）；）；酶酶切切点点太太多多，它它有有5个个BamH1位位点点（GGATCC），6个个 Bg位位 点点（AGATCT），5个个 EcoR位位 点点（GAATTC）。）。野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的 DNA。若
14、相当于。若相当于噬噬菌体的菌体的 75-105%，那么只能接纳，那么只能接纳 49kb5%=2.45 kb的的 DNA。噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：噬菌体的改造噬菌体的改造 切切去去非非必必须须区区段段，在在切切去去的的同同时时，加加载载目目的的基基因因（或更大）；（或更大）；去处太多的酶位点，每种酶只留去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口；增加标记基因（增加标记基因（remarke gene）。）。3.噬菌体的主要类型噬菌体的主要类型（1）插入型载体）插入型载体 只有只有12种限制性核酸内切酶的单一切割位点种限制性核酸内切酶的单一切割位点 免疫功能失活免疫功能失活大肠杆菌大肠杆菌
15、-半乳糖苷酶失活半乳糖苷酶失活（2）替换型载体替换型载体 在其中央部位有一个可以被外源插入的在其中央部位有一个可以被外源插入的 DNA 分子取代的分子取代的 DNA 片段的克隆载体片段的克隆载体。这是由于构建此载体时，安排在中。这是由于构建此载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此，当央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此，当外源外源 DNA 插入时，一对克隆位点之间的插入时，一对克隆位点之间的 DNA 片段便会被片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源置换掉，从而有效提高了克隆外源 DNA 片段的能力。片段的能力。（二）M13 噬菌体载体 M13 噬菌体属丝
16、状噬菌体，其基因组为闭合环噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链状正链 ssDNA，6407 bp，其中，其中 90%的的DNA都都编码蛋白质，有编码蛋白质，有 10 个基因，有两个较长的间隔个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。区，是外源基因插入的部位。M13 M13 噬菌体产生单双链噬菌体产生单双链 DNA DNA 的机制的机制1、以（、以（+）链）链 DNA为摸板，为摸板，合成互补（）链，该双合成互补（）链，该双链称复制型链称复制型 DNA（RFDNA）。）。2、RFDNA 在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约细胞约 200 个拷
17、贝。个拷贝。3 3、单链特异的、单链特异的DNADNA结合蛋白结合在（结合蛋白结合在（+）链上，从而阻）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（断的合成（+）链）链 DNA DNA。4 4、游离出来的（、游离出来的（+）链）链 DNA DNA 先与基因先与基因V V的编码产物形成的编码产物形成特异的特异的 DNA-DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因同时基因V V的蛋白质从（的蛋白质从（+）DNA DNA 链上脱落下来，余下的链上脱落下来，余下的 M13M13（+）链）
18、链 DNA DNA 则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。+-+-+-+-+-+-单链结合蛋白单链结合蛋白RF型型DNA复制约复制约200copy+以以-链链DNA为模为模板合成板合成+链链DNA三、噬菌粒载体（科斯质粒，三、噬菌粒载体（科斯质粒，cosmidcosmid）1、构建、构建由质粒和由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成的。借用噬菌体的粘性末端构建而成的。借用cos-（粘性（粘性尾巴）作字头，质粒的尾巴）作字头，质粒的-mid作字尾，故称作字尾，故称 Cosmid，也叫，也叫粘粒载体
19、。粘粒载体。2、特点、特点（1）有有噬菌体的高效感染能力。噬菌体的高效感染能力。（2 2）有质粒的高效复制特性。）有质粒的高效复制特性。（3 3）有更广泛寄主。）有更广泛寄主。（4 4）有较大的容量。）有较大的容量。四、酵母菌载体四、酵母菌载体 多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为，称为 2质粒，长约质粒，长约 6.3 kb，有单一的复制起始，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。片段）。根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、附加型和稳定型等类型
20、。复制型、附加型和稳定型等类型。含含有有 E.coli 质质粒粒的的复复制制起起始始序序列列，这这样样在在外外源源基基因转化到酵母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。因转化到酵母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。含含有有酵酵母母的的筛筛选选标标记记，这这样样当当重重组组质质粒粒转转入入相相应的酵母细胞后，可用来筛选重组体。应的酵母细胞后，可用来筛选重组体。具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。共同的特点：共同的特点：整合型：整合型：含有酵母的筛选标记含有酵母的筛选标记 ura3，但不具有酵，但不具有酵母的复制起始点该质粒母的复制起始点该质粒 DNA DNA 以单
21、拷贝形式稳定遗以单拷贝形式稳定遗传，缺点是转化率较低（传，缺点是转化率较低（1 110 10 转化子转化子/g/g DNADNA）.复制复制型：型：是酵母是酵母 DNA 片段插入到大肠杆菌质粒中片段插入到大肠杆菌质粒中构成的，插入片段含有酵母的筛选标记构成的，插入片段含有酵母的筛选标记 ura3 和和 2u DNA 片段，一般以低拷贝数维持在酵母染色体片段，一般以低拷贝数维持在酵母染色体之外。复制型载体对酶母的转化率极高（之外。复制型载体对酶母的转化率极高（102103 转化子转化子/g DNA），但是转化子不稳定，容易丢失。），但是转化子不稳定，容易丢失。附加型：附加型：是在是在 pBR32
22、2 中插入酵母筛选标记和中插入酵母筛选标记和2uDNA 的的 ARS 序列构建成的。这种质粒以附加序列构建成的。这种质粒以附加体的形式存在于真核细胞中。附加型型载体对酵体的形式存在于真核细胞中。附加型型载体对酵母具有很高的转化活性（母具有很高的转化活性（102103 转化子转化子/g DNA），且与复制型相比，稳定性高，拷贝数也），且与复制型相比，稳定性高，拷贝数也较高（较高（25100分子分子/细胞）。细胞）。稳定型：稳定型：在附加型载体中再插入酵母着丝粒的一在附加型载体中再插入酵母着丝粒的一个个 DNA片段（片段（CEN）。）。第二节第二节 植物基因工程载体植物基因工程载体 一、根癌农杆菌
23、及一、根癌农杆菌及Ti质粒质粒（一）根癌农杆菌与冠瘿瘤（一）根癌农杆菌与冠瘿瘤 根癌农杆菌属根瘤菌科农杆菌属，通过伤口可感染双子叶根癌农杆菌属根瘤菌科农杆菌属，通过伤口可感染双子叶植物，并在创伤部位使组织恶性增生而形成植物肿瘤，叫植物，并在创伤部位使组织恶性增生而形成植物肿瘤，叫冠瘿瘤（冠瘿瘤（crown gall tumor）。）。冠瘿碱冠瘿碱类植物激素类植物激素 章鱼碱章鱼碱胭脂碱胭脂碱农杆碱农杆碱（二）（二）TiTi质粒及质粒及 T-DNA T-DNA 的结构与功能的结构与功能 Ti质粒是农杆菌非染色体的环状双链质粒是农杆菌非染色体的环状双链 DNA 分子，分子，分子量为分子量为 901
24、06150106 道尔顿，有道尔顿，有160240 kb。致病菌株致病菌株37培养培养治愈菌株治愈菌株（Ti 质粒被消除）质粒被消除）治愈菌株治愈菌株 与致病菌株接合与致病菌株接合致病菌株（重新获得致病菌株（重新获得Ti质粒）质粒）1.T-DNA 区区胭脂碱型质粒胭脂碱型质粒 T 区大小约区大小约 23 kb，单一序列插入，单一序列插入植物核植物核 DNA。章鱼碱型章鱼碱型左区左区(TL-DNA)：长约长约 13 kb，通常为，通常为单拷贝，有诱发和维持肿瘤的作用。单拷贝，有诱发和维持肿瘤的作用。右区右区(TR-DNA)：长约长约 7kb，多拷贝，多拷贝含有参与冠瘿碱生物合成的蛋白酶的含有参与
25、冠瘿碱生物合成的蛋白酶的编码基因。编码基因。图章鱼碱章鱼碱pTiAch5和胭脂碱和胭脂碱pTiC58质粒的遗传图质粒的遗传图共同区：共同区：T 区有控制肿瘤形态和编码冠瘿碱合成酶区有控制肿瘤形态和编码冠瘿碱合成酶基因，实际上基因，实际上shi基因与生长素合成有关。基因与生长素合成有关。roi 基因基因与细胞分裂素合成有关，与细胞分裂素合成有关，Ocs 是章鱼碱合成酶基因，是章鱼碱合成酶基因，Agr 是编码农杆碱合成酶基因，章鱼碱型与胭脂碱是编码农杆碱合成酶基因，章鱼碱型与胭脂碱型的型的 T 区中上述基因分布不完全一致，但区中上述基因分布不完全一致，但 90是是相同的称共同区。相同的称共同区。3
26、 个同源区段，含有个同源区段，含有 6 个基因位点，是冠瘿个基因位点，是冠瘿瘤形成所必需的，统称瘤形成所必需的，统称“致癌基因致癌基因”(oncogene，onc)。非同源序列则编码冠瘿碱合成酶，在胭脂非同源序列则编码冠瘿碱合成酶，在胭脂碱型中叫碱型中叫 Nos，章鱼碱型酶叫，章鱼碱型酶叫 Ocs。共同区共同区已知已知 T-DNA 的两侧是被一对保守的的两侧是被一对保守的 25 bp 的重的重复序列包围着，而且在一系列不同的植物肿瘤复序列包围着，而且在一系列不同的植物肿瘤DNA 中发现，中发现，T-DNA 的两边端点是位于这种同的两边端点是位于这种同向重复序列的当中或附近，这种同向重复序列实向
27、重复序列的当中或附近，这种同向重复序列实际上就是际上就是T-DNA 的边缘区。的边缘区。右侧边缘区又叫右侧边缘区又叫 RB 序列，左侧边缘区又叫序列，左侧边缘区又叫LB 序列。序列。2、毒性毒性Vir 区区VirA、B、D和和G为致瘤性，它们的突变型为非致病性。为致瘤性，它们的突变型为非致病性。VirA、C、D 编码专一核酸内切酶蛋白，与编码专一核酸内切酶蛋白，与 VirB 共共同作用，与同作用，与 T-DNA 迁移直接有关。迁移直接有关。VirC 部分决定寄主范围部分决定寄主范围VirE 与菌体感染过程有关与菌体感染过程有关Vir 区大约区大约 35 kb，包含，包含 6 个互补群，个互补群
28、，A、B、C、D、E、G。3、代谢区代谢区Tra，T-DNA 转移功能；转移功能；Agr，农杆碱代谢；，农杆碱代谢；Inc，不同类型质粒代谢相容性；，不同类型质粒代谢相容性；Occ 和和 Noc，章鱼碱和胭脂碱分解代谢。，章鱼碱和胭脂碱分解代谢。（三）农杆菌对寄主的侵染和（三）农杆菌对寄主的侵染和 T-DNA 的转移的转移 1、侵染过程、侵染过程2、T-DNA 的转移的转移（1）创伤植物细胞释放出可激活）创伤植物细胞释放出可激活Ti质粒质粒 Vir 基因进行转录的基因进行转录的蛋白因子；蛋白因子；（2）VirA 和和 VirD 蛋白因子进一步激活其它的蛋白因子进一步激活其它的 Vir 基因进行
29、基因进行表达；表达；（3）先在）先在Ti质粒右侧边缘区产生出头一个单链缺口；质粒右侧边缘区产生出头一个单链缺口；（4）接着在）接着在 Ti 质粒左侧边缘区产生出另一个单链缺口，结果质粒左侧边缘区产生出另一个单链缺口，结果释放出的单链释放出的单链 T-DNA 分子便定向地转移到植物细胞，并随机分子便定向地转移到植物细胞，并随机整合到寄主染色体基因组上；整合到寄主染色体基因组上；（5）Ti 质粒中移走的单链质粒中移走的单链 T-DNA 区，通过区，通过 DNA 复制得到修复制得到修复。复。（四）（四）Ti质粒作为植物基因工程的载体质粒作为植物基因工程的载体 1、可行性、可行性（1 1）将细菌转座子
30、）将细菌转座子 Tn7 插入胭脂碱合成酶基因插入胭脂碱合成酶基因（Nos）位置上，该）位置上，该Ti质粒仍能实现质粒仍能实现 T-DNA 转移。转移。（2 2）用）用 Cat与与 Nos Nos 和和 Ocs Ocs 基因启动子拼接后，基因启动子拼接后，重组进入重组进入 Ti 质粒，质粒，Ti 质粒感染植物，植物细胞中质粒感染植物，植物细胞中检测到了检测到了 Cat 基因的酶的存在。基因的酶的存在。（1）转化植物细胞很难形成完整植株。）转化植物细胞很难形成完整植株。（2）质粒上分布着多个酶切位点，而不是单一切）质粒上分布着多个酶切位点，而不是单一切点，酶切后不易成环，给插入目的基因带来困难。点
31、，酶切后不易成环，给插入目的基因带来困难。（3）Ti 质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，可农杆菌对可农杆菌对Ti的转化率太低，只有的转化率太低，只有 109107 左右左右。2、存在缺陷、存在缺陷（五）（五）Ti质粒的改造质粒的改造 1、去除致瘤基因去除致瘤基因Onc 由于影响植株再生的直接原因是由于影响植株再生的直接原因是 T-DNA 中的中的Onc 基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，记为使成为无毒的质粒，记为 Onc，这个过程叫，这个过程叫“卸甲卸甲”、“缴械缴械”或或“解除武装解除武装”，构
32、建的，构建的Onc载体叫载体叫“卸甲载体卸甲载体”。例：例：pGV38502、共整合质粒共整合质粒（1 1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌）首先构建中间载体，如将大肠杆菌 pBR322质粒带质粒带上一段与上一段与 Ti 质粒质粒T区同源的一个片段，它在大肠杆菌和区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；农杆菌中均能复制；（2 2）然后将目的基因插入该片段的适当位置，这样使目）然后将目的基因插入该片段的适当位置，这样使目的基因两端带上了与的基因两端带上了与 Ti 质粒质粒 T-DNA 同源的同源的 DNA 序列；序列；（3 3）然后再将该质粒通过转化或接合引入含有）然后再将该质粒通过转化
33、或接合引入含有 Ti 质粒质粒的农杆菌中。的农杆菌中。（4 4）引入的衍生质粒和原细胞中）引入的衍生质粒和原细胞中 Ti 质粒具同源性，质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到转到 Ti 质粒上，使之产生真正的具有外源基因的质粒上，使之产生真正的具有外源基因的 Ti 质粒，称共整合质粒。质粒，称共整合质粒。3、双元载体双元载体“双元载体双元载体”，也称反式载体，是指由两个分别也称反式载体，是指由两个分别含含T-DNA 和和 Vir 相容性相容性Ti质粒构成的双质粒系统。质粒构成的双质粒系统。含有为含有为 T-DNA 转移所必
34、须的转移所必须的 Vir 区的质粒，区的质粒，另一个则是含有另一个则是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。4、载体盒载体盒 所谓所谓“载体盒载体盒”(Vector cassette)是将植物的标志是将植物的标志基因、多插入位点、细菌标志基因和质粒的复制基因、多插入位点、细菌标志基因和质粒的复制启动子位点等集于一身的质粒系统，象一个集装启动子位点等集于一身的质粒系统，象一个集装箱似的集合在一起。箱似的集合在一起
35、。二、二、Ri 质粒载体质粒载体 三、三、CaMV(花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒)载体系统载体系统 Ri质粒其结构和功能与质粒其结构和功能与 Ti 十分相似十分相似。与与Ti质粒相比的优点：可以构建完整的质粒相比的优点：可以构建完整的 Onc+载体。载体。花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒 (caulimovirus，简称，简称 CaMV)实际上是一实际上是一个病毒群，已知有个病毒群，已知有 12 个种，每个种的寄主范围都很窄，个种，每个种的寄主范围都很窄，不感染豆类和单子叶植株，它的主要寄主是芸苔属。不感染豆类和单子叶植株，它的主要寄主是芸苔属。CaMV DNA 有有两两个个特特别别之之点点，一一
36、是是在在专专一一位位点点有有不不连连续续性性，DNA 链链上上有有一一处处到到三三处处不不连连续续；另另一一点点是是在在电电镜镜下下观观察察到到 DNA 大部分有盘绕结构，看上去似超螺旋。大部分有盘绕结构，看上去似超螺旋。1、互补载体系统互补载体系统 2 2、混合载体系统、混合载体系统 缺陷性缺陷性CaMV+辅助病毒分子辅助病毒分子 将将CaMV DNA克隆到了克隆到了Ti质粒上，通过农杆菌导质粒上，通过农杆菌导入植物细胞，可产生典型的病毒感染症状。入植物细胞，可产生典型的病毒感染症状。3、CaMV35S启动子融合基因载体系统启动子融合基因载体系统 SalI Kmr SalISalITi质粒质
37、粒T-DNA区区SalI Kmr SalI混合载体构建过程混合载体构建过程SalISalISalI四、脂质体四、脂质体(liposomes)(liposomes)载体载体（一）、脂质体结构与性质（一）、脂质体结构与性质 脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂双分子层围脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂双分子层围成的囊状结构，这种结构是一种分子排列有序的成的囊状结构，这种结构是一种分子排列有序的近晶型液晶。近晶型液晶。脂质体的主要成分是磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂脂质体的主要成分是磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺等。酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺等。制备方法：制备方法：有超声波法、机械振荡法、透析法、
38、有超声波法、机械振荡法、透析法、融合法以及逆向蒸发法等。融合法以及逆向蒸发法等。（二）（二）脂质体与细胞的相互作用脂质体与细胞的相互作用 脂质体作为载体的机理脂质体作为载体的机理:与细菌球质体的作用是相似与细菌球质体的作用是相似的，它能将的，它能将 DNA 包埋在里边，在包埋在里边，在 PEG 诱导下，通过诱导下，通过细胞的吞噬或融合作用将内含物转入受体细胞，最终与细胞的吞噬或融合作用将内含物转入受体细胞，最终与受体核受体核 DNA 结合。结合。脂质体与细胞的相互作用主要有以下几种形式：脂质体与细胞的相互作用主要有以下几种形式：1.内吞作用内吞作用2.融合作用融合作用3.交换作用交换作用 优点
39、：优点：使包装在里边的物质（质粒或使包装在里边的物质（质粒或 DNA）能避开核酸）能避开核酸酶的降解，对受体无毒性，易被吸收，运送率高，转化率酶的降解，对受体无毒性，易被吸收，运送率高，转化率高。更重要的是脂质体制备比常用的质粒载体要容易得多，高。更重要的是脂质体制备比常用的质粒载体要容易得多，价格低廉，技术操作也简单得多。价格低廉，技术操作也简单得多。第三节第三节 动物基因工程载体动物基因工程载体整合型：整合型：即外源基因通过这种病毒载体整合到宿主细胞即外源基因通过这种病毒载体整合到宿主细胞的染色体上，随着宿主细胞基因组的复制而扩增。的染色体上，随着宿主细胞基因组的复制而扩增。游离型：游离型
40、：或称病毒颗粒型，携带有外源基因的这类载体，或称病毒颗粒型，携带有外源基因的这类载体，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗粒的本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗粒的形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒的存在下进行复形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒的存在下进行复制。制。一、一、SV401、SV40 基因组基因组其基因组为共价闭合环状双链其基因组为共价闭合环状双链 DNA，只有，只有 5243 个碱基对。个碱基对。早期基因：产生早期基因：产生 T 和和 t抗原抗原复制起点（复制起点（ori）晚期基因：转译出壳蛋白晚期基因：转译出壳蛋白VP1、VP2、VP32、SV40 的
41、复制和增殖的复制和增殖（1）SV40 感染敏感的猿猴细胞后，经过感染敏感的猿猴细胞后，经过 812 小小时的潜伏期，脱去外壳，时的潜伏期，脱去外壳，DNA 进入细胞核。进入细胞核。（2）首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生）首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生 T和和 t 抗原。抗原。（3）当两种抗原积累到足够量时，）当两种抗原积累到足够量时，DNA 开始复制，开始复制，同时启动晚期转录，翻译产生壳蛋白，将同时启动晚期转录，翻译产生壳蛋白，将DNA 包包装成病毒颗粒。装成病毒颗粒。（4）当细胞内病毒颗粒多达）当细胞内病毒颗粒多达 105 时，细胞破裂，时，细胞破裂，释放出大量病毒颗粒。释放出大
42、量病毒颗粒。3、构建、构建SV40 克隆载体的基本策略和途径克隆载体的基本策略和途径（1）晚期取代载体）晚期取代载体将将SV40 的晚的晚期基因区域期基因区域用合适的限用合适的限制性酶切割制性酶切割后，即可用后，即可用外源基因取外源基因取代切割掉的代切割掉的晚期区域。晚期区域。（2）早期取代载体）早期取代载体早期取代载体是早期取代载体是通过用通过用 EcoRI和和NodI双酶切去掉双酶切去掉早期基因区域，早期基因区域，然后用外源基因然后用外源基因代替去掉的早期代替去掉的早期基因区域而获得基因区域而获得的。的。（3）穿梭载体）穿梭载体 可以认为这种克隆载体是质粒克隆载体的衍生物，由可以认为这种克
43、隆载体是质粒克隆载体的衍生物，由 SV40 的的 DNA 片段与质粒重组而成。片段与质粒重组而成。优点，优点，如：遗传背景清楚，容易制备，拷贝数高，病毒如：遗传背景清楚，容易制备，拷贝数高，病毒的早期功能及晚期功能都有温度敏感突变株等。的早期功能及晚期功能都有温度敏感突变株等。缺陷：缺陷：SV40 重组病毒转染细胞，随着病毒的繁殖，重组病毒转染细胞，随着病毒的繁殖，细胞便裂解；细胞便裂解；容纳外源容纳外源 DNA 能力较小，如构建晚期取代载能力较小，如构建晚期取代载体时，去掉一段晚期体时，去掉一段晚期 DNA 后，插入的外源后，插入的外源 DNA不能大于不能大于 2500 bp。存在安全隐患。存在安全隐患。二、其它病毒载体二、其它病毒载体牛乳头瘤病毒杆状病毒，牛乳头瘤病毒杆状病毒，RNA 肿瘤病毒、腺病毒，肿瘤病毒、腺病毒，单纯疱疹病毒及痘苗病毒等单纯疱疹病毒及痘苗病毒等