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1、基因工程载体1现在学习的是第1页，共71页载体类型基因工程所用的载体都经过人工重新构建 细菌质粒载体 噬菌体衍生载体 Cosmid载体（粘粒）噬菌体M13衍生载体 Phagemid载体 酵母质粒载体 真核病毒载体2现在学习的是第2页，共71页克隆载体与表达载体克隆载体：携带外源DNA进入受体细胞并 使外源DNA大量扩增。表达载体：表达外源基因编码的蛋白质，载体克隆位点的上游应含有启动子，下游含有转录终止序列。3现在学习的是第3页，共71页第一 节.质粒 Plasmid质粒是存在于细菌细胞染色体外、能自主复制的小分子环状双链DNA分子。又称为cccDNA（Covalently Closed Ci
2、rcular DNA）。4现在学习的是第4页，共71页野生型质粒的大小一般在2-200Kb 基因工程常用者在2-4Kb之间 质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。5现在学习的是第5页，共71页质粒质粒(plasmid)6现在学习的是第6页，共71页1.质粒类型:严紧型质粒(stringent plasmid)1-5个拷贝/细胞 松弛型质粒(relaxed plasmid):数十个/细胞质粒在细胞中的拷贝数有时与寄主的种类有关。7现在学习的是第7页，共71页2.质粒载体必须具备的条件（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存）分
3、子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。）等。8现在学习的是第8页，共71页（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。活，而便于筛选。9现在学习的是第9页，共71页质粒性质不相容性（
4、不亲和性）具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒，不能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象称作质粒的不相容性。10现在学习的是第10页，共71页3.质粒载体的选择性标记 抗菌素抗性 新陈代谢特性11现在学习的是第11页，共71页 抗菌素名称抗菌素名称 抗菌素作用方式抗菌素作用方式 宿主菌抗性机理宿主菌抗性机理氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp）干扰细菌细胞壁合成干扰细菌细胞壁合成 编码编码-内酰胺酶内酰胺酶,切割切割Amp -内酰胺环内酰胺环氯霉素（氯霉素（Cml）抑菌剂抑菌剂,与与50S结合结合,干扰干扰 编码乙酰转移酶编码乙酰转移酶,使使氯霉素氯霉素 蛋白质蛋白质合成合成 乙酰化失活乙酰
5、化失活卡那霉素（卡那霉素（Kan）杀菌剂杀菌剂,与与70S结合结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶编码氨基糖苷磷酸转移酶,发生错读发生错读 修饰修饰Kan失活失活链霉素链霉素（Sm）杀菌剂杀菌剂,与与30S结合结合,mRNA 编码特异修饰酶编码特异修饰酶 发生错读发生错读四环素（四环素（Tet）抑菌剂抑菌剂,与与30S结合，阻止结合，阻止 编码特异蛋白编码特异蛋白,修饰细菌膜修饰细菌膜 蛋白合成蛋白合成 结构结构,阻止阻止Tet通过细胞膜通过细胞膜12现在学习的是第12页，共71页复制起点氨苄青霉素抗性基因13现在学习的是第13页，共71页常用的质粒载体1.pBR3222.220载体是我国预
6、防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体。3.pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。14现在学习的是第14页，共71页15现在学习的是第15页，共71页16现在学习的是第16页，共71页17现在学习的是第17页，共71页4.融合表达载体如GST融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。当基因表达时，表达产物为GST与目的蛋白的融合体。18现在学习的是第18页，共71页融合表达载体的优点 表达效率高 融合蛋白易纯化：抗GST的蛋白质作为特异性抗体，用亲和层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白；可从
7、融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点，可用适当的酶切割。19现在学习的是第19页，共71页例如加装一段编码Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子a切割，从Arg后切开。目的蛋白中出现此种序列的可能性极小，因此该方法用途广泛。20现在学习的是第20页，共71页QIAexpress 6His表达系统 重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的结构和功能，无需切除。6个组氨酸残基免疫原性差，重组蛋白可以直接用做抗原。21现在学习的是第
8、21页，共71页第二节第二节 噬菌体类噬菌体类 噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名为为Bacteriophage,简称简称phage。噬菌体可以在脱。噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但必须依离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。赖寄主细胞才能复制生长。22现在学习的是第22页，共71页噬菌体（bacteriophage,phage）噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。病毒的特性：个体微小，可以通过细菌滤器 没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成 专性细胞内寄生的微生物 可分为12个科23现在学习的是
9、第23页，共71页噬菌体的生物学性状24现在学习的是第24页，共71页噬菌体的生物学性状 形态 个体小，需用电子显微镜观察 蝌蚪形、微球形和丝形The black bars are size bars representing 100 nm.25现在学习的是第25页，共71页26现在学习的是第26页，共71页27现在学习的是第27页，共71页 用作克隆载体的噬菌体有两类：一类是用作克隆载体的噬菌体有两类：一类是噬菌体噬菌体，另一类是，另一类是M13噬菌体。噬菌体。野生型野生型噬菌体经过改造，已衍生出噬菌体经过改造，已衍生出100多种多种克隆载体。克隆载体。噬菌体载体分为插入型和替换型噬菌体载体
10、分为插入型和替换型(置换置换型型)两类。两类。目前应用较广的是目前应用较广的是EMBL系列、系列、gt系列和系列和Charon系列等。系列等。28现在学习的是第28页，共71页噬菌体（lambda phage)噬菌体是可以感染细菌的病毒，是大肠杆菌的温和型噬菌体。由外壳蛋白外壳蛋白与一个48.5kb的双链线状双链线状DNA分子组成。经过改造形成的噬菌体载体有较高的转化效率。29现在学习的是第29页，共71页在在噬菌体DNA分子双链的5端，各有一段由12个核苷酸组成的互补的单链凸出序列，即通常所说的黏性末端。在寄主细胞内，会通过黏性末端的互补作用，形成环型双链DNA分子。这种由黏性末端结合形成的
11、双链区段称为cos位点。（cos:cohensive end site)30现在学习的是第30页，共71页 3CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT3 在黏性末端的12个碱基中，有10个是GC。通过碱基配对线性分子环化起来，由此形成的双链区，叫做cos位点。31现在学习的是第31页，共71页 噬菌体基因组含50余个基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因对噬菌体的生长不是必须的，可以被外源DNA片段取代。噬菌体上有56种限制性内切酶的识别位点，约300余切点。比如BamHI分别在第5505、22346、27972、34499和41732处有识别位点。32现在学习的是第32页，共71页噬
12、菌体的生长途径 噬菌体有溶原和溶菌两种生长途径。溶原生长途径是指噬菌体的DNA整合在宿主染色体上，随宿主染色体的复制而复制。以原噬菌体的形式潜伏起来。一旦宿主细胞处于某种条件下时，噬菌体的DNA脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。33现在学习的是第33页，共71页 溶菌生长是指噬菌体在宿主细胞中黏性末端连接，成为环形DNA分子，借用宿主细胞的体系，合成病毒包装所需的外壳蛋白，新复制的DNA与外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。宿主细胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞。34现在学习的是第34页，共71页噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis
13、pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)35现在学习的是第35页，共71页M13噬菌体 单链DNA,基因组含6407个碱基.经过基因改造后，形成M13mp系列。可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7倍).M13噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但妨碍宿主细胞的生长,因此可见培养平板上的混浊噬菌斑.36现在学习的是第36页，共71页噬斑37现在学习的是第37页，共71页 单链的M13噬菌体（）进入受体菌后，以自身为模板，复制出互补链（），成为双链的结构，称为复制型DNA。复制型DNA在细胞内可达200个拷贝。此时，（）链被特异的蛋白质阻断，不再生成新的
14、（）链。只能生成新的（）链。（）链DNA被壳蛋白包装组成病毒颗粒，挤出宿主细胞。38现在学习的是第38页，共71页科斯质粒载体（cosmid）又称粘粒载体，简称粘粒。环形双链DNA分子，一般为46Kb。该载体含有DNA的cos序列（不少于280个bp）和pBR322质粒的序列。该载体转化效率高。可容纳高达45kb的外源DNA。以感染方式进入宿主细胞,在宿主体内象质粒那样复制.39现在学习的是第39页，共71页 粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。又能像DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。属松弛型质粒，拷贝数较多。40现在学习的是第40页，共71页
15、41现在学习的是第41页，共71页农杆菌Ti质粒 根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌与植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤，故名Ti质粒（tumor inducing plasmid）。Ti质粒为双链环状DNA分子，200250Kb之间。Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约25kb，称为T-DNA（transfer DNA）。42现在学习的是第42页，共71页 T-DNA两端各有一个25bp的正向重复序列，在不同的Ti质粒中是高度保守的，该序列对于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。利用大肠杆菌质粒与T-DNA的部分序列重组，构建Ti质粒克隆载体，可用于植物细胞的基因转移。43现在学习的
16、是第43页，共71页第三节 酵母细胞基因工程载体 酵母是最简单的单细胞真核生物。酵母可对表达的多肽链进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、糖基化、除去N端的甲硫氨酸等。44现在学习的是第44页，共71页酵母菌的克隆载体YIP 酵母整合型质粒YRP 酵母复制型质粒YEP 酵母附加子型载体CIP 酵母菌着丝粒型质粒45现在学习的是第45页，共71页上述质粒均可在大肠杆菌和酵母菌中稳定存在，即所谓的穿梭质粒穿梭质粒。这些质粒含有两种可供筛选的选择性标记。46现在学习的是第46页，共71页YIp载体URA3 乳清苷酸脱羧酶47现在学习的是第47页，共71页 酵母菌表达载体1.选择性标志 当使用大肠杆菌做
17、为宿主细胞时，多使用抗生素抗性作为筛选标志。由于酵母菌对许多抗生素不敏感，故需要其他的筛选标志。野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、TRP1（色氨酸）这些基因可补偿酵母菌细胞中某一种特定的代谢缺陷（营养缺陷）48现在学习的是第48页，共71页2.启动子含有可被RNA聚合酶II识别的酵母启动子 GAL、GAL10（半乳糖激酶）PHO5（碱性磷酸酶）ADH（醇脱氢酶）TP1 （丙糖磷酸异构酶）PGK （磷酸甘油酸激酶）GAP（磷酸甘油醛脱氢酶）SUC （蔗糖酶）49现在学习的是第49页，共71页注释：细胞内某些蛋白质丰度较高，如PGK （磷酸甘油酸激酶）、GAP（磷酸甘油醛脱氢酶）
18、，各占细胞总蛋白的5%，属于高含量的蛋白质，它们的启动子为强启动子。50现在学习的是第50页，共71页酵母分泌型表达载体 这类载体可以使目的蛋白分泌到细胞外。载体内除含有一般表达质粒的必要成分外，还需有一个控制蛋白质分泌的信号序列。其编码的多肽链叫做信号肽。信号肽内多含疏水性氨基酸。51现在学习的是第51页，共71页第四节 哺乳动物细胞表达载体52现在学习的是第52页，共71页病毒侵入动物细胞后，有两种生长状态 溶细胞感染 病毒在宿主细胞内合成自身的核酸和结构蛋白，装配成完整的子代病毒颗粒，释放到细胞外，扩大感染，宿主细胞因为代谢障碍而死亡。整合性感染 病毒核酸整合到宿主细胞的染色体中，随细胞
19、DNA的复制而扩增。53现在学习的是第53页，共71页病毒载体：（1）含有能够被真核细胞识别的有效启动子 （2）在感染周期中能够持续复制，达到很高的拷贝数。（3）控制自己复制的元件 （4）有些载体可高效稳定地整合到寄主基 因组上 （5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基 因高效导入受体细胞。54现在学习的是第54页，共71页1.SV40病毒病毒载体载体SV40：猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus 40)环型双链DNA分子，含5243bp。优点：1.感染率高；2.拷贝数高；3.转录产物 高；缺点：1.宿主范围窄；2.最终导致感染细胞死 亡；3.制备耗时，成本较高。55现
20、在学习的是第55页，共71页SV40病毒载体的改建病毒的部分序列质粒的部分序列 如PSV2 包括 病毒的复制起始区、早期启动子、增强子序列、部分t抗原基因 pBR322的复制起始区、氨苄青霉素 抗性基因56现在学习的是第56页，共71页病毒-质粒载体 病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的质粒分子重组而成。例如：pC10早期区段和复制起点（多瘤病毒）质粒pBR322的部分区段 这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。57现在学习的是第57页，共71页改造后的病毒优缺点 优点：优点：1.不需病毒颗粒的包装过程，故可插入较大长 度的DNA片段。2.不引起宿主细胞的裂解
21、，可建立稳定传代的 细胞株。3.整合到宿主细胞的染色体中，重组基因不会丢失。缺点：转染效率低于万分之一。58现在学习的是第58页，共71页受纳细胞：SV40感染CV-1或AGMK猿猴细胞后，产生感染性病毒颗粒，并使宿主细胞裂解，这种感染称为裂解感染，而猿猴细胞则称为受纳细胞。59现在学习的是第59页，共71页非受纳细胞：SV40感染仓鼠细胞后，不产生感染颗粒，病毒基因组整合到宿主细胞染色体上，细胞被转化（癌变），这种啮齿类动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞。60现在学习的是第60页，共71页逆转录病毒载体 逆转录病毒是一类单链RNA病毒。宿主范围广，感染动物或人的细胞。感染效率高，理论上可达1
22、00。具有强启动子。不引起宿主细胞的死亡，可以维持许多代存在问题：1.容量小，低于10kb。2.可能引起细胞癌变。61现在学习的是第61页，共71页腺病毒载体（AV）线性双链DNA病毒，经过改造的腺病毒载体，缺失了大部分的病毒基因，更加安全。62现在学习的是第62页，共71页 优点：基因组大，可插入大片段的外源基因，最多可 达 35kb；可高效的感染不同类型的人体组织细胞；进入细胞内不整合进宿主的基因组，仅瞬间表达。缺点 免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；几乎可感染所有的细胞，缺乏特异性。63现在学习的是第63页，共71页腺相关病毒载体（AAV）：属于非致病的微小 病毒科家族的成员，只有依赖
23、于辅助病毒才能繁殖。特点：基因组小，只有几个kb；无致病性；免疫原性弱；装载外源基因容量小，不超过5kb；制备过程复杂 ；64现在学习的是第64页，共71页痘苗病毒载体：痘苗病毒是动物病毒中最大的一种，与天花病毒有密切的亲缘关系。长期被用作预防天花的疫苗。病毒基因组中有很大的非必需区（28kb），可以切除，代之以较大的外源基因，或者同时插入几个外源基因，构成多价疫苗。65现在学习的是第65页，共71页哺乳动物细胞基因转移的选择标记 氨基糖苷磷酸转移酶：G418 二氢叶酸还原酶（DHFR）MTX（氨甲喋呤）胸苷激酶（TK）：APT（氨基喋呤）潮霉素-B-磷酸转移酶（HPH）：潮霉素-B 黄嘌呤-
24、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）：霉酚酸 腺嘌呤核糖脱氨酶（ADA）：66现在学习的是第66页，共71页嘌呤和嘧啶合成知识的回顾 哺乳动物细胞内的两条合成途径1 从头合成：利用各种小分子，如氨基酸、CO2、NH3、磷酸核糖等，合成嘌呤或嘧啶环，进而合成核苷酸。2 补救合成途径：利用细胞内原有的或从胞外吸收的碱基、核苷、核苷酸。67现在学习的是第67页，共71页1.从头合成途径：利用小分子合成核苷酸，包括胸苷酸2.补救合成途径：利用细胞内现有的碱基、磷酸合成核苷酸，包括胸苷酸氨甲喋呤可阻挡此途径胸苷激酶等68现在学习的是第68页，共71页当培养基中混有氨基喋呤时，会干扰细胞从头合成嘌呤和嘧啶的
25、代谢途径。TK+细胞可利用环境中的胸苷合成胸苷一磷酸，由此可以存活。而TK-细胞不能利用环境中的胸苷合成胸苷一磷酸，因而死亡。69现在学习的是第69页，共71页如 胸苷胸苷激酶 TK胸苷一磷酸若一细胞株缺乏胸苷激酶，则标示为TK细胞，此种细胞若被置于混有氨基喋呤和胸苷的培养基中，将无法存活。而TK阳性细胞可存活。当TK细胞转入了外源的胸苷激酶基因，则在混有氨基喋呤和胸苷的培养基中，可正常生长。70现在学习的是第70页，共71页第五节 昆虫细胞表达载体杆状病毒是许多昆虫的天敌，应用杆状病毒作为昆虫细胞表达载体，用途越来越广。基因组特点：较大，约100150kb，其中的多角体蛋白编码基因是复制的非必需区，启动子功能强大。可将外源基因插入其内。后又发现最晚期表达的一种蛋白质，其编码基因也是复制非必需区，可用作外源基因插入区域。71现在学习的是第71页，共71页