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1、基因工程载体植物基因工程本章重点掌握的内容1.掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、-互互补、插入失活、人工染色体载体的概念。补、插入失活、人工染色体载体的概念。2.克隆载体克隆载体DNA分子具备的条件。分子具备的条件。3.标记基因的分类及其作用。标记基因的分类及其作用。4.质粒克隆载体用途。质粒克隆载体用途。5.-DNA载体的构建、类型及其优点。载体的构建、类型及其优点。6.植物表达载体的组成、启动子的类型等植物表达载体的组成、启动子的类型等 遗传物质遗传物质+载体载体 重组的重组的DNADNA分子分子 引入细胞或生物体内引入细胞或生物体
2、内 复制与表达复制与表达 稳定地遗传给下代稳定地遗传给下代 为什么要用到载体？为什么要用到载体？基因工程流程图基因工程流程图为什么需要载体？为什么需要载体？1）独立的一个包括启动子（）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（、编码区（encodingregion)和终止子（和终止子（terminator)的基因，的基因，or组成基因的某个元组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的；件，一般是不可以进入受体细胞的；2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。载体的概念载体的概念u载体（载体（vector)基因工程中，携
3、带目的基因进入宿主细胞进行扩基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。增和表达的工具称为载体。u目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体高效表达，在很大程度上决定于载体。载体的功能载体的功能载体的功能载体的功能u运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞u为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件u为外源基因提供整合能力为外源基因提供整合能力载体的要求载体的要求A A、复制起点：能在受体中复制；复制起点：能在受体中复制；B B、选择标记和、选择标记和筛
4、选标记；筛选标记；C C、限制性内切酶切割位点限制性内切酶切割位点（多克隆位点）（多克隆位点）；D D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；载体的大小：原则上要求载体越小越好；E E、适当的拷贝数；适当的拷贝数；F F、载体的安全性：质粒不能随便转移载体的安全性：质粒不能随便转移;G G、外源基因的表达：启动子、外源基因的表达：启动子。大肠杆菌质粒载体大肠杆菌质粒载体pBR322结构图结构图 复制起点复制起点选择标记基因选择标记基因克隆位点克隆位点克隆位点克隆位点载体的分类载体的分类按功能分类按功能分类克隆载体克隆一个基因或克隆载体克隆一个基因或DNA片断片断表达载体用于一个基因的蛋白表达表达
5、载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中整合载体把一个基因插入到染色体组中按来源分类按来源分类质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体柯斯质粒载体柯斯质粒载体人工染色体载体人工染色体载体载体的种类和特征载体的种类和特征质粒质粒受体细胞受体细胞结构结构插入片断插入片断举例举例 E.coli环状环状8kbpUC18/19,pBR322等等噬菌体载体噬菌体载体E.coli线状线状9-24kbEMBL系列，系列，gt系列系列丝状噬菌体及噬菌粒载体丝状噬菌体及噬菌粒载体E.coli环状环状10kbM13mp系列系列粘粒载体载体粘粒载体载体E.coli环状环状35-45kbpJB8,c2R
6、B,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)载体载体E.coli环状环状300kbpBeloBAC11YAC(YeastArtificialchromosome)载体载体酵母细胞酵母细胞线性染色体线性染色体100-2000kbpYAC4MAC(MammalianArtificialChromosome)载体载体哺乳类细胞哺乳类细胞线性染色体线性染色体1000kbpCXLamIntWT,pCXLamIntRandpCXLamIntROK病毒载体病毒载体动物细胞动物细胞环状环状SV40载体，昆虫载体，昆虫杆状病毒载体杆状病毒载
7、体穿梭载体穿梭载体动物细胞动物细胞和细菌和细菌环状环状pSVK3质粒，质粒，PBV,Ti质粒质粒第一节第一节克隆载体克隆载体一、质粒载体一、质粒载体1.质粒的概念质粒的概念质粒（质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型菌染色体外的小型环状环状双链双链DNA分子，可分子，可自主复制和表达自主复制和表达。并不是寄主生长所必需的，但可以赋并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力的能力（带有抗性基因等）（带有抗性基因等）。分子量在分子量在1-200kb之间之间。一、质粒载体一、质粒载体大肠杆菌的质粒
8、大肠杆菌的质粒一、一、质粒载体质粒载体2.质粒的空间构型质粒的空间构型共价闭合环状共价闭合环状DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)呈超螺旋（呈超螺旋（SC）（）（supercoil）一、一、质粒载体质粒载体开环开环DNA（opencircular，ocDNA）一条链上有一至数个缺口。一条链上有一至数个缺口。线形线形DNA（linear，LDNA）一、一、质粒载体质粒载体同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：SCDNA最快、最快、LDNA次之、次之、OCDNA最慢。最慢。SC OC L 一、一、质粒
9、载体质粒载体3.质粒的基本特性粒的基本特性质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。复制系统进行自主复制。质粒质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒（stringentplasmid）(拷贝数少，为拷贝数少，为1-5个个)和和松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒（relaxed）(拷贝数多，可达拷贝数多，可达10
10、-200个拷个拷贝贝)因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。质粒质粒复制子复制子拷贝数拷贝数pBR322及其衍生质粒及其衍生质粒pMB11520pUC系列质粒及其衍生质粒系列质粒及其衍生质粒突变的突变的pMB1500700pSC101及其衍生质粒及其衍生质粒pSC1015ColE1ColE11520一、质粒载体一、质粒载体质粒的不相容性质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性又称质粒的不亲和性)两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为具有不
11、相容性的质粒组成的群体称为不相容群不相容群，一般具有相，一般具有相同的复制子。同的复制子。以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 一、一、质粒载体质粒载体质粒的可转移性质粒的可转移性接合型质粒接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。细胞（接合作用）。非接
12、合型质粒非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。不能在天然条件下独立地发生接合作用。值得注意的是，某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助值得注意的是，某些非接合型质粒在接合型质粒的存在和协助下下，也也能能发发生生DNA转转移移，这这个个过过程程由由mob、tra基基因因、顺顺式式作作用用原原件件bom及其内部的转移缺口位点及其内部的转移缺口位点nic决定。决定。一、一、质粒载体质粒载体Tra protein from conjugative plasmidbom siteMob genemob mRNAMob proteinopen recipient cellhelper plas
13、mid即即mob基因的产物可打开非接合质粒的基因的产物可打开非接合质粒的oriT位点位点，借助接合质，借助接合质粒粒tra基因的产物基因的产物，使非接合质粒，使非接合质粒被动迁移到被动迁移到受体细胞中，这受体细胞中，这种现象称为种现象称为迁移作用迁移作用(mobilization)。质粒的可转移性质粒的可转移性一、质粒载体一、质粒载体大肠杆菌接合（大肠杆菌接合（conjunctionconjunction）质粒质粒DNADNA的的tratra基因基因E.ColiE.Coli产生菌毛产生菌毛宿主与受体细胞结合宿主与受体细胞结合遗传物在细胞之间转移遗传物在细胞之间转移（指令）（指令）（迁移）（迁移
14、）一、一、质粒载体质粒载体携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记野生型的质粒野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义一、一、质粒载体质粒载体遗传标记基因遗传标记基因定义定义:在基因工程中用来筛选导入了重组在基因工程
15、中用来筛选导入了重组DNA的的细胞的基因。细胞的基因。选择标记基因、筛选标记基因选择标记基因、筛选标记基因标记基因的作用标记基因的作用1.指示外源指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞2.指示外源指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子分子是否插入载体分子形成了重组子 一、一、质粒载体质粒载体遗传标记基因的种类遗传标记基因的种类1.抗性标记基因（可直接用于选择转化子）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）a.抗生素抗性基因抗生素抗性基因:Apr，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr，Neorb.重金属抗性基因重金属抗性基因:Cu
16、r，Znr，Cdrc.代谢抗性基因代谢抗性基因:TK，抗除草剂基因，抗除草剂基因2.营养标记基因（可直接用于选择转化子）营养标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这这类基因在酵母转化中使用最频繁，如类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。等。3.生化标记基因生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ（-半乳糖苷半乳糖苷酶），），GUS（葡萄糖苷酸（葡萄糖苷酸酶），），CAT（过氧化氧化氢酶）一、一、
17、质粒载体质粒载体一、一、质粒载体质粒载体抗抗药药性性标标记记选选择择(插插入入失失活活法法)一、一、质粒载体质粒载体常用的筛选标记基因常用的筛选标记基因-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ和和lacZ）一种能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的一种能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。-半乳糖苷酶基因的优点半乳糖苷酶基因的优点:a.催化催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观水解为兰色产物，检测直观b.lacZ编码编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性端可容许很大的变化而不影响酶活性c.lacZ和和链基因的分别表达可使载体小而容量大链基因的分别表达可使载体小而容量大一、一、质粒载体质粒载体互补（蓝白
18、班筛选）互补（蓝白班筛选）野生型大肠杆菌产生的野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴溴-4-靛蓝。靛蓝。-半乳糖苷酶缺陷型菌株中编码半乳糖苷酶缺陷型菌株中编码-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的-半乳半乳糖苷酶失去正常糖苷酶失去正常N段一个段一个146个氨基酸的短肽（个氨基酸的短肽（即即肽链肽链），从而不具有生物活性，），从而不具有生物活性，即无法作用于即无法作用于X-gal产生蓝色物质。产生蓝色物质
19、。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因，的基因，lacz中包括：一段中包括：一段-半乳糖苷半乳糖苷酶的启动子；编码酶的启动子；编码肽链的区段；一个多克隆位点肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。当菌体中含有带当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒的质粒后，质粒lacz基因编码的基因编码的肽链和菌株基因组表达的肽链和菌株基因组表达的端缺陷的端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即生成蓝色物质的能力，这种现象即-互补互补。操作中，添加。操作中，
20、添加IPTG(异丙基硫代异丙基硫代-半乳糖苷半乳糖苷)以激活以激活lacz中的中的-半乳糖苷酶的启动子，在含有半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养的固体平板培养基中基中菌落呈现蓝色菌落呈现蓝色。当外源当外源DNA（即目的片断）与含（即目的片断）与含lacz的载体连接时，会插入进的载体连接时，会插入进MCS，使，使肽链读肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达码框破坏，这种重组质粒不再表达肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无互补作用，互补作用，不产生活性不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即产生
21、蓝色，培养表型即呈现白色菌落呈现白色菌落。一、一、质粒载体质粒载体PLacZLacZ 转录转录 翻译翻译 LacZ基因的结构与产物基因的结构与产物一、一、质粒载体质粒载体lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解乳糖分解乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P大肠杆菌的大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系统系统一、一、质粒载体质粒载体lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解乳糖分解乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P-肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTGa-互互补补显显色色反反应应（蓝蓝白白斑斑筛筛选选）-半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因lacZ突突变变体体M15？一、一、质粒载体
22、质粒载体X-galX-gal-peptideC-terminusof-galactosiase一、一、质粒载体质粒载体互补显色反应互补显色反应 一、一、质粒载体质粒载体-互互补补(-complementation)一、一、质粒载体质粒载体常用的筛选标记基因常用的筛选标记基因葡萄糖苷酸酶基因（葡萄糖苷酸酶基因（GUS）该基因编码一种可分解各种该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。为许多生物中没有这
23、种基因。荧光素酶基因荧光素酶基因荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌产生的倍；或由发光细菌产生的荧光素酶，它与荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。的变化测定酶活。发光蛋白质基因发光蛋白质基因发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。菌菌落呈蓝色。一、一、质粒载体质粒载体4.质粒
24、的命名原粒的命名原则人工组建的质粒人工组建的质粒人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的）的第一个字符第一个字符p，用小写。，用小写。p后有后有2个字母是大写，表示质粒的作者和个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母，字母p代表质代表质粒，粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表代表构建的一系构建的一系质粒的编号。质粒的编号。一、一、质粒载体质粒载体5.质粒粒载体的体的发展概况展概况第一阶段第一阶段（1977年前）天然质
25、粒和重组质粒的利用，年前）天然质粒和重组质粒的利用，如如pSC101,ColE1,pCR,pBR313和和pBR322。第二阶段第二阶段增大载体容量（降低载体长度），建立多克增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。系列载体。第三阶段第三阶段完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如要求，如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。表达型载体及各种探针型载体。一、一、质粒载体质粒载体6.质粒粒载体构建体构建天然存在的野生
26、型质粒由于天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC1018.8kb拷贝数拷贝数5四环素抗性标记基因四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124
27、ColE1衍生质粒衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因氨苄青霉素抗性标记基因Ampr一、一、质粒载体质粒载体 第一个用于基因第一个用于基因克隆的天然质粒克隆的天然质粒,克隆位点少，克隆位点少，Tetr作为筛选标志。作为筛选标志。A、删除不必要的删除不必要的DNA区域区域:尽量缩小质粒的分子量，以提尽量缩小质粒的分子量，以提高外源高外源DNA片段的装载量。片段的装载量。B、减少限制性酶切点减少限制性酶切点:缺失突变，限制性酶、核酸外切酶缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶的共同作用，质粒之间的重组等方法。和连接酶的共同作用，质粒之间的重组等方法。C、加入易于识别的选择标记：加入易于识别的选择标记：通
28、过质粒之间的重组，可以通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。使质粒带有合适的选择性标记。D、安全性能改造：安全性能改造：质粒载体不能在细菌之间随便转移。质粒载体不能在细菌之间随便转移。E、改造或加入基因表达的调控序列：、改造或加入基因表达的调控序列：启动子。启动子。质粒的改造质粒的改造pBR322:4.3KbApr/TcrPstI/BamHI、SalI/HindIII、EcoRI一、一、质粒载体质粒载体一、一、质粒载体质粒载体7.质粒粒载体的分体的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒高拷贝质粒突变拷贝数控制基因
29、突变拷贝数控制基因拷贝数拷贝数1000-3000扩增基因扩增基因低拷贝质粒低拷贝质粒来自来自pSC101拷贝数小于拷贝数小于10表达某些毒性基因表达某些毒性基因温敏质粒温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒整合质粒装有整合促进基因及位点装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭质粒穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆便于基因克隆表达质粒表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译
30、、纯化的元件装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒探针质粒装有报告基因装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选一、一、质粒载体质粒载体8.常用常用质粒粒载体体（1）pBR322复制起点复制起点ori：pMB1系列（来源于系列（来源于ColE1）高拷贝型高拷贝型复制起点复制起点Ampr基因：基因：pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因Tetr基因：基因：pSC101的的Tetr 基因。基因。长度：长度：4363bp选择标记：选择标记：氨苄青霉素和四环素抗性。氨苄青霉素和四环素抗性。克隆位点：克隆位点：含有多个克隆位点。含有多个克隆位点。Ampr基因内可被
31、基因内可被PstI，PvuI，SacI切开，而切开，而Tetr基因可被基因可被BamHI，HindIII切开，通切开，通过插入失活插入失活筛选重重组子。子。一、一、质粒载体质粒载体pBR322质粒载体优点：质粒载体优点：第一，具有较小的分子量第一，具有较小的分子量4363bp。第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细第三，具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可累积胞中可累积10003000个拷贝。个拷贝。一、一、质粒载体质粒载体一、一、质粒载体质粒载体（2）pUC系
32、列质粒载体系列质粒载体在在pBR322的基础上改造而成。其组成如下：的基础上改造而成。其组成如下：含有含有pBR322完整的完整的Ampr基因和复制起始点。基因和复制起始点。含有大肠杆菌含有大肠杆菌-半乳糖酶基因半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编的启动子及其编码码-肽链的肽链的DNA序列，即序列，即lacZ基因。基因。在在lacZ基因中靠近基因中靠近5端的一段有端的一段有MCS区段，但并不区段，但并不破坏该基因的功能。破坏该基因的功能。pUC18、pUC19生命科学学院生命科学学院一、一、质粒载体质粒载体一、一、质粒载体质粒载体pUC质粒载体的优点：质粒载体的优点：具有较小的相对分子质量和
33、更高的拷贝数，平均每个细具有较小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达胞可达500-700个拷贝。个拷贝。适用于适用于组织化学方法检测重组体组织化学方法检测重组体，有来自大肠杆菌有来自大肠杆菌lac操纵子的操纵子的lacZ基因，所编码的基因，所编码的-肽链可参与肽链可参与-互补作用，互补作用，在在IPTG诱导和底物诱导和底物X-gal存在下，形成蓝色和白色菌落存在下，形成蓝色和白色菌落筛选重组体。筛选重组体。具有具有MCS区段，便于外源基因的克隆。区段，便于外源基因的克隆。一、一、质粒载体质粒载体（3）穿梭质粒载体）穿梭质粒载体(shuttlevector)：这种质粒分子上含有两个亲缘
34、关系不同的复制子结构以及这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，如大肠杆菌胞中复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。酵母菌穿梭质粒等。一、质粒载体一、质粒载体TA克隆载体克隆载体(补充补充)用用Taq酶的酶的PCR产物产物3端加上了一个端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线。根据这一特点研制出一种线性质粒，其性质粒，其5端突出的端突出的T，它们之间可以连接，即，它们之间可以连接，即TA克隆。克隆。再生再生TA克隆载
35、体的方法：克隆载体的方法：克隆载体的线性化克隆载体的线性化克隆载体末端补平克隆载体末端补平克隆载体末端加克隆载体末端加T一、一、质粒载体质粒载体二、噬菌体载体二、噬菌体载体噬菌体（噬菌体（Bacteriophage）即细）即细菌病毒，是感染细菌、真菌、放菌病毒，是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称。其核心是一段总称。其核心是一段DNA(线性线性)，外围有一个蛋白质外壳和尾巴，外围有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。注入细菌内。二、噬菌体载体二、噬菌体载体噬菌体或病毒的噬菌体或病毒的DNA能被开
36、发成为基因工程的能被开发成为基因工程的有用载体，因为：有用载体，因为：1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；细胞；2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增高效扩增。二、噬菌体载体二、噬菌体载体(一一)噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体；噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体；噬菌体由外壳包装蛋白和噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成；组成；DNA在噬菌体中是双链线状在噬菌体中是双链线状DNA分子，全长分子，全长48.5kb，有，有60多个基多个基因，因，其中有其中有1/3的区域
37、是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，并不影响噬菌体的增殖，这就是，这就是噬噬菌体可作为基因载体的依据菌体可作为基因载体的依据。cos位点位点（cohesiveendsite):在在DNA两端各有两端各有12nt的的5单链突出单链突出(5-GGGCGGCGACCT-3)，彼此序列互补。它是包装时的切割信号。，彼此序列互补。它是包装时的切割信号。二、噬菌体载体二、噬菌体载体噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期二、噬菌体载体二、噬菌体载体粘性末端：粘性末端：12bp的互补单链的互补
38、单链 当当噬菌体进入寄主细胞内后噬菌体进入寄主细胞内后,其粘性末端能通过碱基互其粘性末端能通过碱基互补作用补作用,形成环状形成环状DNADNA分子。粘性末端形成的双链区域称为分子。粘性末端形成的双链区域称为coscos位点位点,它是它是包装蛋白的识别位点包装蛋白的识别位点。噬菌体的包装与噬菌体的包装与DNADNA特性和其它序列无关特性和其它序列无关,但对包装的但对包装的DNADNA大小有要求大小有要求,包装范围大约在包装范围大约在36kb-51kb36kb-51kb。二、噬菌体载体二、噬菌体载体噬菌体作为构建载体材料的依据：噬菌体作为构建载体材料的依据：噬菌体是一种温和噬菌体；噬菌体是一种温和
39、噬菌体；能承载比较大的外源能承载比较大的外源DNA片段；片段；在在噬菌体分子上有许多限制性核酸酶识别位点，便于噬菌体分子上有许多限制性核酸酶识别位点，便于多种多种DNA酶切片段的克隆。酶切片段的克隆。二、噬菌体载体二、噬菌体载体(二二)构建构建噬菌体的基本原理噬菌体的基本原理(1)噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：基因组太大（基因组太大（48.5kb）；）；酶切点太多，它有酶切点太多，它有5个个BamH1位点（位点（GGATCC），），6个个Bg位点（位点（AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于。若相当于噬菌
40、体噬菌体的的75-105%，那么只能接纳，那么只能接纳48.5kb5%=2.425kb的的DNA。重组的重组的DNA分子难于直接导入宿主细胞，需在体外分子难于直接导入宿主细胞，需在体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA。二、噬菌体载体二、噬菌体载体(三三)构建构建噬菌体的基本内容噬菌体的基本内容构建构建噬菌体克隆载体的基本策略：噬菌体克隆载体的基本策略：切去部分非必须的区域；切去部分非必须的区域；抹去多余的限制性内切酶切割位点；抹去多余的限制性内切酶切割位点；插入可供选择的标记基因；插入可供选择的标记基因；建立体外包装系统。建立体外包装系统。二、
41、噬菌体载体二、噬菌体载体选择标记选择标记 (1)imm434 imm434基因编码一种阻止基因编码一种阻止-噬菌体噬菌体进入裂解循环的阻遏物。含有完整标进入裂解循环的阻遏物。含有完整标记基因的记基因的-载体进入受体细胞后，建载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浑浊斑浊斑；当外源；当外源DNA插入到标记基因中，插入到标记基因中，基因灭活，基因灭活，-重组分子便进入溶菌循重组分子便进入溶菌循环，形成环，形成透明斑透明斑。二、噬菌体载体二、噬菌体载体选择标记选择标记 (2)lacZ LacZ基因编码基因编码-半乳糖半乳糖苷酶，能催化无色的苷酶，能催化无
42、色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基生成蓝色化合物。当外源基因插入到因插入到lacZ基因中，基因基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体而空载体-DNA则产生蓝色则产生蓝色透明斑。透明斑。二、噬菌体载体二、噬菌体载体选择标记选择标记 (3)cI基因基因 cI基基因因的的表表达达促促进进噬噬菌菌体体进进入入溶溶原原状状态态，cI基基因因产产物物活性受到影响会促进活性受到影响会促进噬菌体进入裂解循环。噬菌体进入裂解循环。hfl hfl（high frequency of lysogenizationhigh frequency of lysogenization）
43、高频溶原突变突变的）高频溶原突变突变的大肠杆菌大肠杆菌 。二、噬菌体载体二、噬菌体载体(四四)噬菌体载体的类型噬菌体载体的类型 （1）插入型载体）插入型载体只有只有12种限制性核酸内切酶的单一切割位点种限制性核酸内切酶的单一切割位点筛选标记基因：筛选标记基因：-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因、cI基因基因二、噬菌体载体二、噬菌体载体（1）插入型载体）插入型载体载体长度载体长度37kb插入位点插入位点体外包装体外包装插入片段大小：插入片段大小：0-14kb（5137）插入片段插入片段体外包装体外包装二、噬菌体载体二、噬菌体载体gt10 gt10 载体载体cI基因内有一个基因内有一个EcoRI位点位
44、点二、噬菌体载体二、噬菌体载体(四四)噬菌体载体的类型噬菌体载体的类型 （2）替换型载体）替换型载体在其中央部位有一个可以被外源在其中央部位有一个可以被外源DNA分子取代的分子取代的DNA片段的克隆片段的克隆载体载体。如：。如：EMBL3生命科学学院生命科学学院二、噬菌体载体二、噬菌体载体二、噬菌体载体二、噬菌体载体Spi筛选筛选野生型野生型噬菌体在带有噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性原噬菌体的溶原性E.coil的的生长会受到限制的表型，称作生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对，即对P2噬菌体的干扰噬菌体的干扰敏感。这种生长抑制作用是受敏感。这种生长抑制作用是受噬菌体噬菌体red和和gam
45、这两个基因这两个基因编码的产物控制的。如果编码的产物控制的。如果噬菌体缺少两个参与重组的基因噬菌体缺少两个参与重组的基因red和和gam，同时带有，同时带有chi位点，并且宿主菌为位点，并且宿主菌为rec+，则可以，则可以在在P2溶原性溶原性E.coil中生长良好，中生长良好，噬菌体的这种表型称作噬菌体的这种表型称作Spi-。因此，通过。因此，通过噬菌体载体噬菌体载体DNA上的上的red和和gam基因的缺基因的缺失或替换，可在失或替换，可在P2噬菌体溶原性细菌鉴别重组和非重组噬菌体溶原性细菌鉴别重组和非重组噬噬菌体。菌体。二、噬菌体载体二、噬菌体载体插入型载体插入型载体替换型载体替换型载体re
46、d gam二、噬菌体载体二、噬菌体载体(五五)常用的常用的噬菌体载体噬菌体载体 （一）（一）半乳糖苷失活插入型载体半乳糖苷失活插入型载体（二）（二）免疫功能失活插入型载体免疫功能失活插入型载体（三）（三）Charon系列取代型载体系列取代型载体（四）（四）EMBL系列取代型载体系列取代型载体（五）（五）Spi-正选择取代型载体正选择取代型载体（六）（六）ZAP插入型载体插入型载体 二、噬菌体载体二、噬菌体载体(六六)Lambda噬菌体载体的克隆原理及步骤噬菌体载体的克隆原理及步骤二、噬菌体载体二、噬菌体载体(七七)-DNA重组分子的体外包装重组分子的体外包装噬菌体噬菌体DNA体外重组后，一般必
47、须经过体外包装，然体外重组后，一般必须经过体外包装，然后将重组后将重组DNA通过噬菌体导入通过噬菌体导入E.coli细胞内。细胞内。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少少E组份组份，另一部分则缺少，另一部分则缺少D组份组份。包装时，当且仅当这两。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也
48、是基于安全而设计的。二、噬菌体载体二、噬菌体载体D基因缺失的基因缺失的噬噬菌体突变株（菌体突变株（D-）E基因缺失的基因缺失的噬噬菌体突变株（菌体突变株（E-）EproteinDprotein重组重组DNA（裂解物）（裂解物）（裂解物）（裂解物）infectassembleBHB2688-E-的溶原菌的溶原菌BHB2690-D-的溶原菌的溶原菌噬菌体的体外包装系统噬菌体的体外包装系统二、噬菌体载体二、噬菌体载体-DNA作为载体的优点作为载体的优点u-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌u-DNA载体的装载能力为载体的装载能力为25kb，
49、远远大于质粒的装载量，远远大于质粒的装载量u重组重组-DNA分子的筛选较为方便分子的筛选较为方便u重组重组-DNA分子的提取较为简便分子的提取较为简便u-DNA载体适合克隆和扩增外源载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外片段，但不适合表达外源基因源基因二、噬菌体载体二、噬菌体载体M13、f1、fd都为丝状单链都为丝状单链DNA噬菌体噬菌体。优越性：优越性：1.单链单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的为媒介的，这种复制形式的DNA简称简称RFDNA；2.不论是不论是RFDNA还是还是ssDNA都能感染大肠杆菌；都能感染大肠杆菌
50、；3.单链单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多的多寡制约的，不存在包装限制问题；寡制约的，不存在包装限制问题；4.容易测定外源容易测定外源DNA片断的插入取向；片断的插入取向；5.可产生含外源片断的单链可产生含外源片断的单链DNA分子。分子。二、噬菌体载体二、噬菌体载体M13噬菌体载体噬菌体载体M13噬菌体噬菌体是一种含单链（是一种含单链（+）环）环状状DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为菌体，其基因组大小为6.4kb。用作载。用作载体时利用其双链状态的体时利用其双链状态的RFDNA。这类载体主要用来获得大量的单链这类载体主