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1、培养基质量控制作业指导书1、目的：为加强我微生物实验室的工作管理,保证实验室的检测质量,特制定此作业指导书;2、范围：本规范适用于实验室微生物检测中所使用培养基的质量控制。3、职责:3.1 检验人员:按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制,确保培养基符合相关标准的要求。3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。4、控制措施：41培养基的购置和验收4.1。1 培养基的购置试剂管理员在接到批准的采购信息后，从合格供应商中选择厂商采购，同时要求厂商提供每批培养基的批号、使用前的pH值、储藏信息、有效期、性能评价记录（包括测试菌株、技术数据清单、质控证书及必要的安全危
2、害数据）。4。1。2 培养基的验收购买培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。同时应填写“培养基验收检查记录单”验收符合要求后，交由检测人员接受保管，填写培养基入库记录和建立试剂台帐。4 2培养基的储存干粉培养基应保存在阴凉干燥处,要避免阳光直射;开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在有效期或6个月内用完.应每月对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查,如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。开封的脱水培养基，每次使用前应对其质量进行检查，通过粉末的流
3、动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基的质量变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。即用性培养基按照产品标识要求进行储存。4 3培养基的使用4.3.1配制培养基用水和玻璃器皿培养基制备用水应使用电阻率不小于30万cm的蒸馏水或与其同质的水,每周检测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。制备培养基所用的玻璃器皿（如吸管、试管、烧杯等）新的玻璃器皿（首次使用)和再次使用的玻璃器皿按规定方法洗涤、干燥4.3.2称量 称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖。4.3。3复水 复水时应注意以下事
4、项：a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长;b）容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；c）加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基;d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热；e)含有琼脂粉的培养基,在加热溶解之前可以浸泡数分钟；f）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；g）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。4。3。4灭菌 培养基采用高压蒸汽
5、灭菌（湿热灭菌），通常是12115min，含糖或特殊培养基,按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须在15分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度.为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度,必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。4.3。5pH测定 在初次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在25温度下采用精密PH 试纸测试PH值,并判断是否符合要求；使用过程中，如果需要调整培养基的pH,应用1mol/LNaOH或lmol/LHCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压. 4.3.6 配制好的培养基标识和
6、保存灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。同时填写配制记录.内容：名称、配制量、配方(比）、操作中的重要参数(时间、压力、温度)、配制日期、配制者、截止使用日期.在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配制日期、使用期限和配制人。培养基保存注意事项：1）环境条件:各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以28左右为宜，不得冻结。2）保存时限: 基础培养基应在30天内用完.鉴别培养基应在21天内用完。选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完，置保鲜膜（袋)密闭保存期限可延长至一周。从外单位购买的培养基保存时限按照产品标注
7、的时限执行.44培养基批号的的管理培养基的批号由6位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日,各取2位，年份取后2位，月和日不足2位时，分别在数字前加0,表明是本日配制的批号。如2004年6月4日配制的培养基，批号为040604。4。5质量检查购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查（制备好的培养基经3035培养48小时，真菌培养基经2025培养72小时候后，应无菌生长）、新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，经检查合格的该批次培养基方准许使用,否则不准使用，做好检查记录.。成品培养培养基的质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性
8、能测试记录及评估报告4.5 培养基的性能测试新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告,菌株的选择参考SN/T 1538.22007培养基制备指南 第2部分:培养基性能测试实用指南.451物理指标控制1） 测试2025的pH值2）琼脂层厚度；色泽;透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质；452微生物污染的控制从每批制备好的培养基中选取至少一个（或1%）平板或试管，置于35-37或按特定标准中规定的温度培养48h应无菌生长，真菌培养基经2025培养72小时候后,应无菌生长.453微生物学指
9、标控制可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法(详见表1-表)对培养基性能进行测试，具体操作方法如下：（1）生长率将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。1）定量方法生长率PR的计算： PR = NS/NONS：从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。N0：从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应100cfu )。要求：非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0。1；每平板（或每试管）的接种水平为10CFU100CFU。2） 半定量
10、方法半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的总和即为生长指数G，G值不应超过标准规定的允许范围。3) 定性方法定性方法采用划线法观察。选择性将浓度为104CFU/mL106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值。定量方法选择因子SF： SF = DO DSDO：能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度DS：能在测试培养基上显示生长的最高稀释度 要求：非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2 ;半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。生理生化特性(选择性和特异性）规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株
11、对培养基上的目标菌的生理生化特性(菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。(2）性能评价和结果解释按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定，则该批培养基品质优良；若只有物理指标和微生物指标符合规定，则该批培养基可被接收。表1 计数用选择性培养基培养基用途培养条件测试菌株参考培养基控制方法判定标准特征反应Baird-ParkerS生长率372448h金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923TSA定量PR0。5黑色/灰色菌落,周围为一混浊带，其外有透明带选择性3748h大肠杆菌ATCC25922/8739定性全部抑制特异性3724-48h表皮葡萄球菌ATCC12228定性黑色/灰色菌
12、落，周围为一混浊带，其外无透明带MYPS生长率302448h腊样芽胞杆菌ATCC11778TSA定量PR0。7具沉淀带的粉色菌落选择性3748h大肠杆菌ATCC25922-定性全部抑制-特异性3748h 枯草芽胞杆菌ATCC6633-定性不具沉淀带的粉色菌落培养基用途培养条件测试菌株参考培养基控制方法判定标准特征反应VRBG（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂)S生长率3724h大肠杆菌ATCC25922/8739TSA定量PR0.5带有或不带沉淀带的粉红色或红色菌落鼠伤寒沙门菌ATCC14028选择性3720h粪链球菌ATCC29212/19433定性全部抑制VRBL（紫红胆汁乳糖）S生长率3020
13、h大肠杆菌ATCC25922/8739TSA定量PR0.5带有或不带沉淀带的淡紫色菌落选择性3020h粪链球菌ATCC29212/19433定性全部抑制特异性3020h铜绿假单胞菌ATCC27853-定性无色至浅棕色菌落CT-SMAC（改良山梨醇麦康凯琼脂)S生长率3724h大肠杆菌O157：H7ATCC43894/43895TSA定量PR0。5透明菌落，表面淡黄棕色，菌落直径约1mm选择性3724h金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923定性全部抑制特异性3724h大肠杆菌ATCC11775/25922定性-粉色菌落BGBLB（煌绿乳糖胆盐肉汤)L生长率302448h大肠杆菌ATCC259
14、22/8739TSA半定量浊度2+,导管1/3产气产气并浑浊弗氏柠檬酸杆菌ATCC25922/8739选择性粪链球菌ATCC29212/19433定性不生长ECL生长率442448h大肠杆菌ATCC25922半定量浊度2+，导气管1/3产气产气并浑浊选择性442448h铜绿假单胞菌ATCC27853b定性不生长EC-MUG/LSMUGL生长率442448h大肠杆菌ATCC25922半定量浊度2+,导气管1/3产气产气并浑浊，产生荧光选择性442448h铜绿假单胞菌ATCC27853b-定性不生长乳糖胆盐发酵培养L生长率3724h大肠杆菌ATCC25922半定量导气管1/3产气产气并变黄色选择性
15、3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028-定性不产气、仍为紫色LST（月桂酸肉汤）L生长率3724h大肠杆菌ATCC25922-半定量导气管1/3产气选择性3724h福氏志贺氏菌CMCC51572定性-表2 计数用非选择性培养基培养基用途培养条件测试菌株参考培养基控制方法判定标准特征反应PCA（平板计数琼脂）S生长率3072h大肠杆菌ATCC25922/8739TSA定量PR0.7金黄色葡萄球菌ATCC6538枯草芽孢杆菌ATCC6633表3 选择性增菌培养基培养基用途培养条件测试菌株控制方法判定标准特征反应EEL生长率3724h大肠杆菌ATCC25922/8739半定量VRBG上10CFU粉
16、红至红色菌落，有或没有沉淀带鼠伤寒沙门菌ATCC14028选择性粪肠球菌ATCC29212全部抑制RVSL生长率41.524h鼠伤寒沙门菌ATCC14028半定量XLD或其他选择性培养基上10CFU-肠炎沙门氏菌ATCC13076铜绿假单胞菌ATCC27853选择性41。524h大肠杆菌ATCC25922半定量TSA上全抑制粪链球菌ATCC29212TSA上10CFUSC(亚硒酸盐胱氨酸）L生长率3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028半定量XLD或其他选择性培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准）+大肠杆菌ATCC25922+铜绿假单胞菌ATCC27853b选择性3724h大肠杆
17、菌ATCC25922半定量TSA上10CFU-粪链球菌ATCC29212TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）L生长率3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028半定量XLD或其他选择性培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同(见标准）伤寒沙门菌CMCC50071选择性3724h大肠杆菌ATCC25922TSA上10CFU-碱性蛋白胨水L生长率3724h霍乱弧菌CMCC16109半定量TCBS或其他选择性培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同(见标准)副溶血性弧菌CMCC20001选择性3724h大肠杆菌ATCC25922/8739TSA上10CFU-福氏志贺氏菌CMCC515727.5%氯化钠肉汤
18、L生长率3724h金黄色葡萄球菌ATCC6538半定量BP平板或其他培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准)表4 非选择性增菌培养基培养基用途培养条件测试菌株控制方法判定标准特征反应BHI生长率3724h金黄色葡萄球菌ATCC6538定性浊度12-蛋白胨盐L稀释202545min大肠杆菌ATCC25922定量+/-50%菌落数/至（+/-50%原始菌落数金黄色葡萄球菌ATCC25923表4 非选择性增菌培养基（续）培养基用途培养条件测试菌株控制方法判定标准特征反应乳糖蛋白胨肉汤L生长率3724h大肠杆菌ATCC25922定性导气管1/3产气选择性3724h鼠伤寒沙门菌ATCC140
19、28定性SCDLP液体培养基L生长率3724h铜绿假单胞菌ATCC27853定性浊度12-大肠杆菌ATCC25922金黄色葡萄球菌ATCC6538液体沙氏培养基L生长率265天白色念珠菌CMCC98001定性浊度12-真菌培养基L生长率265天白色念珠菌CMCC98001定性浊度12表5 选择性分离培养基培养基用途培养条件测试菌株控制方法判定标准特征反应亚硫酸酸铋琼脂(BS）S生长率3748h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长（2)菌落呈黑色,有金属光泽福氏志贺氏菌CMCC51572菌落呈棕色选择性大肠杆菌ATCC25922/8739全部或部分抑制(01）无典型菌落粪链球菌ATCC29
20、212/19433全部抑制(0)-XLDS生长率3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长(2）菌落呈黑色福氏志贺氏菌CMCC51573菌落呈无色选择性大肠杆菌ATCC25922/8739全部或部分抑制（01)无典型菌落粪链球菌ATCC29212/19433全部抑制(0)-血琼脂平板S生长率372448h金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923定性良好生长溶血，透明溶血环粪链球菌ATCC29212定性良好生长溶血，草绿色溶血环TCBSS生长率372448h霍乱弧菌CMCC16109定性良好生长菌落较大，呈黄色副溶血性弧菌CMCC20001定性良好生长菌落较大，呈绿色4号琼脂S生长率
21、372448h霍乱弧菌CMCC16109定性良好生长菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色非O1群霍乱弧菌CMCC17045定性良好生长菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色选择性3724h大肠杆菌ATCC25922/8739定性全部或部分抑制（01）-表5 选择性分离培养基（续）培养基用途培养条件测试菌株控制方法判定标准特征反应伊红美兰琼脂S生长率3724h大肠杆菌ATCC25922/8739定性良好生长菌落紫黑色带金属光泽鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长菌落灰白色半透明福氏志贺氏菌CMCC51573定性良好生长菌落灰白色半透明TSI(三糖铁琼脂）S生长率3724-48h大肠杆菌A
22、TCC25922/8739定性良好生长斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性普通变形杆菌CMCC49001定性良好生长斜面及底层均变黄,产气，硫化氢阳性福氏志贺氏菌CMCC51573定性良好生长底层变黄，斜面变红，不产气，硫化氢阴性鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长底层变黄，斜面变红，产气，硫化氢阳性表6 非选择性分离培养基培养基用途培养条件测试菌株控制方法判定标准特征反应营养琼脂S生长率3724h大肠杆菌ATCC25922定性良好生长（2)-鼠伤寒沙门菌ATCC14028c小肠耶尔森氏菌ATCC237158.管理8。1。贮存培养基的冰箱（或冰柜）内不得存放食品、饮料等无关物品。8.2.使
23、用前，须仔细检查培养基外观和效期，管理员应按规定的时间检查制备好的培养基的外观：如失水、沉淀、过期、棉花塞松弛或脱落等异常情况，如发现失水、沉淀等异常情况,则同一批号剩余的所有培养基及时全部弃去，不得再用8.3.对于过了效期、瓶塞松驰或脱落的培养基一旦发现立即弃去.9、记录商品化培养基/成品培养基目录清单 培养基试剂入库登记表培养基配制记录培养基质量控制性能测试记录及评估报告培养基标签培养基制备用水检测记录10引用标准10.1 GB/T27405-2008.实验室质量控制规范 食品微生物检测S。10。2 SN/T1538.12005。培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则S。10.3 SN/T1538.2-2007。培养基制备指南 第2部分：培养基性能测实用指南S.