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1、培养基质量控制作业指导书 1、目的：为加强我微生物实验室的工作管理，保证实验室的检测质量，特制定此作业指导书；2、范围：本规范适用于实验室微生物检测中所使用培养基的质量控制。3、职责：检验人员：按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制，确保培养基符合相关标准的要求。科室负责人：负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。4、控制措施：41 培养基的购置和验收 4.1.1 培养基的购置 试剂管理员在接到批准的采购信息后，从合格供应商中选择厂商采购，同时要求厂商提供每批培养基的批号、使用前的 pH 值、储藏信息、有效期、性能评价记录（包括测试菌株、技术数据清单、质控证书及必要的安全危害数
2、据）。4.1.2 培养基的验收 购买培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。同时应填写“培养基验收检查记录单”验收符合要求后，交由检测人员接受保管，填写培养基入库记录和建立试剂台帐。42 培养基的储存 干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在有效期或 6 个月内用完。应每月对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。开封的脱水培养基，每次使用前应对其质量进行检查，通过粉末
3、的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基的质量变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。即用性培养基按照产品标识要求进行储存。43 培养基的使用 4.3.1 配制培养基用水和玻璃器皿 培养基制备用水应使用电阻率不小于 30 万cm 的蒸馏水或与其同质的水，每周检测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。制备培养基所用的玻璃器皿（如吸管、试管、烧杯等）新的玻璃器皿（首次使用）和再次使用的玻璃器皿按规定方法洗涤、干燥 4.3.2 称量 称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖。4.3.3 复
4、水 复水时应注意以下事项：a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；b）容器的大小需大于复水后培养基总体积的 2 倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；c）加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基；d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热；e）含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；f）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；g）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。4.3.
5、4 灭菌 培养基采用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌），通常是 12115min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须在 15 分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度，必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。4.3.5 pH 测定 在初次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在 25温度下采用精密 PH 试纸测试 PH 值，并判断是否符合要求；使用过程中，如果需要调整培养基的 pH，应用 1mol/LNaOH 或 lmol/LHCL 调整，注意不可反复调 pH，否
6、则会影响培养基的渗透压。配制好的培养基标识和保存 灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。同时填写配制记录。内容：名称、配制量、配方（比）、操作中的重要参数（时间、压力、温度）、配制日期、配制者、截止使用日期。在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配制日期、使用期限和配制人。培养基保存注意事项：1）环境条件：各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以 2-8左右为宜，不得冻结。2）保存时限:基础培养基应在 30 天内用完。鉴别培养基应在 21 天内用完。选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完,置保鲜膜(袋)密闭保存期
7、限可延长至一周。从外单位购买的培养基保存时限按照产品标注的时限执行.44 培养基批号的的管理 培养基的批号由 6 位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日，各取 2 位，年份取后 2 位，月和日不足 2 位时，分别在数字前加 0，表明是本日配制的批号。如 2004 年 6 月 4 日配制的培养基，批号为 040604。质量检查 购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查（制备好的培养基经 3035培养 48 小时，真菌培养基经 2025培养 72 小时候后，应无菌生长）、新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，经检查合格的该批次培养基方准许使用，否则不准使用，做好检查记录。成品
8、培养培养基的质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告 培养基的性能测试 新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告，菌株的选择参考 SN/T 培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南。451 物理指标控制 1）测试 2025的 pH 值 2）琼脂层厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质；452 微生物污染的控制 从每批制备好的培养基中选取至少一个（或 1%）平板或试管，置于 35-37或按特定标准中
9、规定的温度培养 48h 应无菌生长，真菌培养基经 2025培养 72 小时候后，应无菌生长。453 微生物学指标控制 可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法（详见表 1-表）对培养基性能进行测试，具体操作方法如下：（1）生长率 将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。1）定量方法 生长率 PR的计算：PR=NS/NO NS：从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。N0：从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应100cfu）。要求：非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为，该类培养基应易于目标菌生长；选
10、择性培养基上目标菌的生长率最低应为；每平板（或每试管）的接种水平为 10CFU100CFU。2）半定量方法 半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的总和即为生长指数 G，G 值不应超过标准规定的允许范围。3）定性方法 定性方法采用划线法观察。选择性 将浓度为 104CFU/mL106CFU/mL 的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值。定量方法 选择因子 SF：SF=DO-DS DO：能在参考培养基上生长至少 10 个菌落的最高稀释度 DS：能在测试培养基上显示生长的最高稀释度 要求：非目标菌在选择性培养基上的 SF至少为 2
11、；半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。生理生化特性（选择性和特异性）规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的生理生化特性（菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。（2）性能评价和结果解释 按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定，则该批培养基品质优良；若只有物理指标和微生物指标符合规定，则该批培养基可被接收。表 1 计数用选择性培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应 Baird-Parker S 生长率 3724-48h 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 TSA 定量 PR 黑色/灰色菌落，周
12、围为一混浊带，其外有透明带 选择性 3748h 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 全部抑制 特异性 3724-48h 表皮葡萄球菌ATCC12228 定性 黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外无透明带 MYP S 生长率 3024-48h 腊样芽胞杆菌ATCC11778 TSA 定量 PR 具沉淀带的粉色菌落 选择性 3748h 大肠杆菌ATCC25922 定性 全部抑制 特异性 3748h 枯草芽胞杆菌ATCC6633 定性 不具沉淀带的粉色菌落 培养基 用途 培养条件 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应 VRBG（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂）S 生长率 3724
13、h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 定量 PR 带有或不带沉淀带的粉红色或红色菌落 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 选择性 3720h 粪链球菌ATCC29212/19433 定性 全部抑制 VRBL（紫红胆汁乳糖）S 生长率 3020h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 定量 PR 带有或不带沉淀带的淡紫色菌落 选择性 3020h 粪链球菌ATCC29212/19433 定性 全部抑制 特异性 3020h 铜绿假单胞菌ATCC27853 定性-无色至浅棕色菌落 CT-SMAC（改良山梨醇麦康凯琼脂）S 生长率 3724h 大肠杆菌 O157：H7 ATCC43894
14、/43895 TSA 定量 PR 透明菌落，表面淡黄棕色，菌落直径约 1mm 选择性 3724h 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 定性 全部抑制 特异性 3724h 大肠杆菌ATCC11775/25922 定性 粉色菌落 BGBLB（煌绿乳糖胆盐肉汤）L 生长率 3024-48h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 半定量 浊度 2+，导管 1/3产气 产气并浑浊 弗氏柠檬酸杆菌 ATCC25922/8739 选择性 粪链球菌ATCC29212/19433 定性 不生长 EC L 生长率 442448h 大肠杆菌ATCC25922 半定量 浊度 2+，导气管1/3产气 产
15、气并浑浊 选择性 442448h 铜绿假单胞菌ATCC27853b 定性 不生长 EC-MUG/LS-MUG L 生长率 442448h 大肠杆菌ATCC25922 半定量 浊度 2+，导气管1/3产气 产气并浑浊，产生荧光 选择性 442448h 铜绿假单胞菌ATCC27853b 定性 不生长 乳糖胆盐发酵培养 L 生长率 3724h 大肠杆菌ATCC25922 半定量 导气管1/3产气 产气并变黄色 选择性 3724h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 不产气、仍为紫色 LST（月桂 生长率 3724h 大肠杆菌 半定 导气管1/3 表 2 计数用非选择性培养基 培养基 用途 培养条件
16、 测试菌株 参考培 养基 控制方法 判定标准 特征反应 PCA（平板计数琼脂）S 生长率 3072h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 定量 PR 金黄色葡萄球菌ATCC6538 枯草芽孢杆菌ATCC6633 表 3 选择性增菌培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 EE L 生长率 3724h 大肠杆菌ATCC25922/8739 半定量 VRBG 上10CFU 粉红至红色菌落，有或没有沉淀带 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 选择性 粪肠球菌ATCC29212 全部抑制 RVS L 生长率 24h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 半定量 XLD 或
17、其他选择性培养基上10CFU 肠炎沙门氏菌ATCC13076 铜绿假单胞菌ATCC27853 选择性 24h 大肠杆菌ATCC25922 半定量 TSA 上全抑制 粪链球菌 ATCC29212 TSA 上10CFU SC(亚硒酸盐胱氨酸)L 生长率 3724h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 半定量 XLD 或其他选择性培养基上10CFU 不同培养基上菌落特征不同（见标准）+大肠杆菌ATCC25922+铜绿假单胞菌ATCC27853b 选择性 3724h 大肠杆菌ATCC25922 半定量 TSA 上10CFU 粪链球菌 ATCC29212 TTB(四硫磺酸钠煌绿增菌液)L 生长率 3724h
18、 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 半定量 XLD 或其他选择性培养基上10CFU 不同培养基上菌落特征不同（见标准）伤寒沙门菌CMCC50071 选择性 3724h 大肠杆菌ATCC25922 TSA 上10CFU 碱性蛋白胨水 L 生长率 3724h 霍乱弧菌CMCC16109 半定量 TCBS 或其他选择性培养基上10CFU 不同培养基上菌落特征不同（见标准）副溶血性弧菌CMCC20001 选择性 3724h 大肠杆菌ATCC25922/8739 TSA 上10CFU 福氏志贺氏菌CMCC51572%氯化钠肉汤L 生长率 3724h 金黄色葡萄球菌ATCC6538 半定量 B-P 平板或其
19、他培养基上10CFU 不同培养基上菌落特征不同（见标准）表 4 非选择性增菌培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 BHI 生长率 3724h 金黄色葡萄球菌ATCC6538 定性 浊度 12 蛋白胨盐 L 稀释 202545min 大肠杆菌ATCC25922 定量+/-50%菌落数/至（+/-50%原始菌落数 金黄色葡萄球菌ATCC25923 表 4 非选择性增菌培养基（续）培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 乳糖蛋白胨肉汤 L 生长率 3724h 大肠杆菌ATCC25922 定性 导气管 1/3 产气 选择性 3724h 鼠伤寒沙
20、门菌ATCC14028 定性 SCDLP 液体培养生长率 3724h 铜绿假单胞菌ATCC27853 定性 浊度 12 基 L 大肠杆菌ATCC25922 金黄色葡萄球菌ATCC6538 液体沙氏培养基L 生长率 265 天 白色念珠菌CMCC98001 定性 浊度 12 真菌培养基L 生长率 265 天 白色念珠菌CMCC98001 定性 浊度 12 表 5 选择性分离培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 亚硫酸酸铋琼脂（BS）S 生长率 3748h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长(2)菌落呈黑色，有金属光泽 福氏志贺氏菌CMCC51572
21、菌落呈棕色 选择性 大肠杆菌ATCC25922/8739 全部或部分抑制（01）无典型菌落 粪链球菌ATCC29212/19433 全部抑制（0）-XLD S 生长率 3724h 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长(2)菌落呈黑色 福氏志贺氏菌CMCC51573 菌落呈无色 选择性 大肠杆菌ATCC25922/8739 全部或部分抑制（01）无典型菌落 粪链球菌ATCC29212/19433 全部抑制（0）-血琼脂平板 S 生长率 372448h 金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923 定性 良好生长 溶血，透明溶血环 粪链球菌ATCC29212 定性 良好生长 溶血,草绿色溶
22、血环 TCBS S 生长率 372448h 霍乱弧菌CMCC16109 定性 良好生长 菌落较大，呈黄色 副溶血性弧菌CMCC20001 定性 良好生长 菌落较大，呈绿色 4 号琼脂 S 生长率 372448h 霍乱弧菌CMCC16109 定性 良好生长 菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色 非 O1 群霍乱弧菌CMCC17045 定性 良好生长 菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色 选择性 3724h 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 全部或部分抑制（01）表 5 选择性分离培养基（续）培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 伊红美兰琼脂 S 生长率 3
23、724h 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 良好生长 菌落紫黑色带金属光泽 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长 菌落灰白色半透明 福氏志贺氏菌CMCC51573 定性 良好生长 菌落灰白色半透明 TSI(三糖铁琼脂)S 生长率 3724-48h 大肠杆菌ATCC25922/8739 定性 良好生长 斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性 普通变形杆菌 CMCC49001 定性 良好生长 斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性 福氏志贺氏菌CMCC51573 定性 良好生长 底层变黄，斜面变红，不产气，硫化氢阴性 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 定性 良好生长 底层变黄，斜面变红，
24、产气，硫化氢阳性 表 6 非选择性分离培养基 培养基 用途 培养条件 测试菌株 控制方法 判定标准 特征反应 营养琼脂 S 生长率 3724h 大肠杆菌ATCC25922 定性 良好生长(2)-鼠伤寒沙门菌ATCC14028c 小肠耶尔森氏菌ATCC23715 8.管理.贮存培养基的冰箱（或冰柜）内不得存放食品、饮料等无关物品。.使用前，须仔细检查培养基外观和效期，管理员应按规定的时间检查制备好的培养基的外观：如失水、沉淀、过期、棉花塞松弛或脱落等异常情况，如发现失水、沉淀等异常情况，则同一批号剩余的所有培养基及时全部弃去，不得再用.对于过了效期、瓶塞松驰或脱落的培养基一旦发现立即弃去。9、记录 商品化培养基/成品培养基目录清单 培养基试剂入库登记表 培养基配制记录 培养基质量控制性能测试记录及评估报告 培养基标签 培养基制备用水检测记录 10 引用标准 GB/T27405-2008.实验室质量控制规范 食品微生物检测S.SN/.培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则S.SN/.培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测实用指南S.