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1、培培养养基基质质量量控控制制作作业业指指导导书书1 1、目的：、目的：为加强我微生物实验室的工作管理，保证实验室的检测质量，特制定此作业指导书；2 2、范围：、范围：本规范适用于实验室微生物检测中所使用培养基的质量控制。3 3、职责：、职责：3.1 检验人员：按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制，确保培养基符合相关标准的要求。3.2 科室负责人：负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。4 4、控制措施：、控制措施：4 41 1 培养基的购置和验收培养基的购置和验收4.1.1培养基的购置试剂管理员在接到批准的采购信息后，从合格供应商中选择厂商采购，同时要求厂商提供每批培养基的批
2、号、使用前的pH 值、储藏信息、有效期、性能评价记录（包括测试菌株、技术数据清单、质控证书及必要的安全危害数据）。4.1.2培养基的验收购买培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。同时应填写“培养基验收检查记录单”验收符合要求后，交由检测人员接受保管，填写培养基入库记录和建立试剂台帐。42 培养基的储存干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在有效期或 6 个月内用完。应每月对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基
3、发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。开封的脱水培养基，每次使用前应对其质量进行检查，通过粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基的质量变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。即用性培养基按照产品标识要求进行储存。43 培养基的使用4.3.1 配制培养基用水和玻璃器皿培养基制备用水应使用电阻率不小于 30 万cm 的蒸馏水或与其同质的水，每周检测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。制备培养基所用的玻璃器皿（如吸管、试管、烧杯等）新的玻璃器皿（首次使用）和再次使用的玻璃器皿按规定方法洗涤、干燥 4.3.2称量称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结
4、果；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖。4.3.3复水复水时应注意以下事项：a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；b）容器的大小需大于复水后培养基总体积的2 倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；c）加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基；d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热；e）含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；f）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；g）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有
5、毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。4.3.4灭菌培养基采用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌），通常是 12115min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须在 15 分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度，必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。4.3.5 pH 测定在初次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在25温度下采用精密 PH 试纸测试 PH 值，并判断是否符合要求；使用过程中，如果需要调整培养基的 pH，应
6、用 1mol/LNaOH 或 lmol/LHCL 调整，注意不可反复调 pH，否则会影响培养基的渗透压。4.3.6配制好的培养基标识和保存灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。同时填写配制记录。内容：名称、配制量、配方（比）、操作中的重要参数（时间、压力、温度）、配制日期、配制者、截止使用日期。在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配制日期、使用期限和配制人。培养基保存注意事项：1）环境条件：各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以 2-8左右为宜，不得冻结。2）保存时限:基础培养基应在 30 天内用完。鉴别培养
7、基应在 21 天内用完。选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完,置保鲜膜(袋)密闭保存期限可延长至一周。从外单位购买的培养基保存时限按照产品标注的时限执行.44 培养基批号的的管理培养基的批号由 6 位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日，各取 2 位，年份取后 2 位，月和日不足 2 位时，分别在数字前加 0，表明是本日配制的批号。如 2004 年 6 月 4 日配制的培养基，批号为 040604。4.5 质量检查购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查（制备好的培养基经 3035培养 48小时，真菌培养基经 2025培养 72 小时候后，应无菌生长）、新购的不同批次的商品化培养基在使用前
8、应进行培养基性能测试，经检查合格的该批次培养基方准许使用，否则不准使用，做好检查记录。成品培养培养基的质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告4.5培养基的性能测试新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告，菌株的选择参考 SN/T 1538.2-2007培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南。451 物理指标控制1）测试 2025的 pH 值2）琼脂层厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质；45
9、2 微生物污染的控制从每批制备好的培养基中选取至少一个（或 1%）平板或试管，置于 35-37或按特定标准中规定的温度培养 48h 应无菌生长，真菌培养基经 2025培养 72 小时候后，应无菌生长。453 微生物学指标控制可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法（详见表 1-表）对培养基性能进行测试，具体操作方法如下：（1）生长率将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。1）定量方法生长率 PR的计算：PR=NS/NONS：从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。N0：从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌
10、落总数应100cfu）。要求：非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为 0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1；每平板（或每试管）的接种水平为10CFU100CFU。2）半定量方法半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的总和即为生长指数 G，G 值不应超过标准规定的允许范围。3）定性方法定性方法采用划线法观察。选择性将浓度为 104CFU/mL106CFU/mL 的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值。定量方法选择因子 SF：SF=DO-DSDO：能在参考培养基上生长至少 10 个菌落的最
11、高稀释度DS：能在测试培养基上显示生长的最高稀释度要求：非目标菌在选择性培养基上的 SF至少为 2；半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。生理生化特性（选择性和特异性）规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的生理生化特性（菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。（2）性能评价和结果解释按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定，则该批培养基品质优良；若只有物理指标和微生物指标符合规定，则该批培养基可被接收。表 1计数用选择性培养基参考培培养基用途培养条件测试菌株养基控制方法判定标准特征反应生长率Baird-37金黄色葡萄球菌黑色/灰色菌落，周TSA定量
12、PR0.5 围为一混浊带，其外有透明带24-48hATCC6538/25923Parker选择性3748hS特异性3724-48h大肠杆菌ATCC25922/8739定性 全部抑制表皮葡萄球菌ATCC12228黑色/灰色菌落，周定性围为一混浊带，其外无透明带具沉淀带的粉色菌落生长率MYP3024-48h腊样芽胞杆菌ATCC11778大肠杆菌ATCC25922枯草芽胞杆菌ATCC6633TSA定量PR0.7选择性3748hS特异性3748h定性 全部抑制定性不具沉淀带的粉色菌落参考培培养基用途培养条件测试菌株养基大肠杆菌VRBG（结晶紫中生长率3724h性红胆盐葡萄糖琼脂）S鼠伤寒沙门菌ATCC
13、14028粪链球菌ATCC25922/8739TSA控制方法判定标准特征反应带有或不带沉淀带定量PR0.5 的粉红色或红色菌落选择性3720h ATCC29212/19433大肠杆菌ATCC25922/8739粪链球菌定性 全部抑制 生长率3020hVRBL（紫红胆汁TSA定量PR0.5带有或不带沉淀带的淡紫色菌落乳糖）选择性3020h ATCC29212/19433S特异性3020h铜绿假单胞菌ATCC27853大肠杆菌 O157：H7CT-SMAC（改良山梨醇麦康凯琼脂）S选择性3724h生长率3724hATCC43894/43895金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923大肠杆菌特异性
14、3724h ATCC11775/25922大肠杆菌ATCC25922/8739BGBLB（煌绿乳糖胆生长率3024-48hATCC25922/8739定性 全部抑制 定性-无色至浅棕色菌落透明菌落，表面淡TSA定量PR0.5 黄棕色，菌落直径约 1mm定性 全部抑制 定性粉色菌落半定弗氏柠檬酸杆菌TSA量浊度 2+，导管 1/3 产气并浑浊产气表 2计数用非选择性培养基参考培养基用途培养条件测试菌株培养基大肠杆菌ATCC25922/87PCA（平板计数琼脂）S枯草芽孢杆菌ATCC6633表 3选择性增菌培养基培养条件控制方法生长率3072h39金黄色葡萄球菌 ATCC6538TSA定量PR0.
15、7控制方法判定标准特征反应培养基用途测试菌株判定标准特征反应大肠杆菌ATCC25922/87EEL生长率3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028粪肠球菌ATCC29212鼠伤寒沙门菌ATCC14028肠炎沙门氏菌半定量半定量39VRBG 上10CFU粉红至红色菌落，有或没有沉淀带选择性全部抑制RVS生长率L41.524hXLD 或其他选择性培养基上ATCC13076铜绿假单胞菌ATCC27853大肠杆菌ATCC25922选择性41.524h粪链球菌ATCC29212鼠伤寒沙门菌ATCC14028XLD 或其他生长率SC(亚硒酸盐胱氨酸)L选择性3724h粪链球菌ATCC29212鼠伤寒沙门菌生
16、长率3724hATCC14028伤寒沙门菌CMCC500713724h大肠杆菌ATCC259223724h+大肠杆菌ATCC25922+铜绿假单胞菌 ATCC27853大肠杆菌ATCC25922半定量TSA 上10CFUb10CFUTSA 上全抑制半定量TSA 上10CFU半定量选择性培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准）TTB(四硫磺酸钠煌绿增菌液)L选择性XLD 或其他选择性培养基上半定量10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准）TSA 上10CFU霍乱弧菌生长率碱性蛋白胨水大肠杆菌L选择性3724h福氏志贺氏菌CMCC515727.5%氯化钠肉汤L生长率B-P 平板或半定
17、量其他培养基不同培养基上菌落特征不同ATCC25922/8739TSA 上10CFU3724hCMCC16109副溶血性弧菌CMCC20001半定量TCBS 或其他选择性培养基上10CFU不同培养基上菌落特征不同（见标准）3724h金黄色葡萄球菌 ATCC6538上10CFU（见标准）表 4非选择性增菌培养基培养条件控制方法培养基用途测试菌株判定标准特征反应BHI生长率3724h金黄色葡萄球菌 ATCC6538大肠杆菌定性浊度 12蛋白胨盐L稀释202545minATCC25922定量金黄色葡萄球菌 ATCC25923+/-50%菌落数/至（+/-50%原始菌落数表 4非选择性增菌培养基（续）
18、培养条件控制方法培养基用途测试菌株判定标准特征反应乳糖蛋白胨肉汤选择L性3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028铜绿假单胞菌SCDLP液体培养基L生长率3724hATCC27853大肠杆菌ATCC25922金黄色葡萄球菌 ATCC6538液体沙氏培养基L真菌培养基L定性生长率3724h大肠杆菌ATCC25922定性导气管 1/3 产气定性浊度 12生长率265天白色念珠菌CMCC98001定性浊度 12生长率265天白色念珠菌CMCC98001定性浊度 12表 5选择性分离培养基培养基用途培养条件测试菌株鼠伤寒沙门菌亚硫酸酸铋琼ATCC14028生长率3748h福氏志贺氏菌CMCC51572大
19、肠杆菌ATCC25922/8739定性良好生长(2)菌落呈棕色控制方法判定标准特征反应菌落呈黑色，有金属光泽脂（BS）S选择性无典型菌落抑制（01）全部或部分粪链球菌ATCC29212/19433鼠伤寒沙门菌ATCC14028生长率福氏志贺氏菌XLD3724hS选择性CMCC51573大肠杆菌ATCC25922/8739粪链球菌ATCC29212/19433金黄色葡萄球菌生长率372448hATCC6538/25923粪链球菌ATCC29212霍乱弧菌TCBS生长率S372448hCMCC16109副溶血性弧菌CMCC20001定性全部或部分良好生长(2)菌落呈无色全部抑制（0）-菌落呈黑色无
20、典型菌落抑制（01）全部抑制（0）-血琼脂平板S定性良好生长溶血，透明溶血环溶血,草绿色溶血环定性良好生长定性良好生长菌落较大，呈黄色定性良好生长菌落较大，呈绿色霍乱弧菌4 号琼脂生长率S372448h非 O1 群霍乱弧菌CMCC17045CMCC16109菌落较大、扁平透定性良好生长明、湿润、中心带有黑色定性良好生长菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色大肠杆菌ATCC25922/8739全部或部分选择性3724h定性抑制（01）表 5选择性分离培养基（续）培养基用途培养条件测试菌株大肠杆菌ATCC25922/8739伊红美兰琼脂S福氏志贺氏菌CMCC51573大肠杆菌ATCC25922/8
21、739普通变形杆菌3724-48h福氏志贺氏菌SCMCC51573鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长不产气，硫化氢阴性底层变黄，斜面变红，CMCC49001定性良好生长 菌落灰白色半透明生长率3724h鼠伤寒沙门菌ATCC14028定性良好生长 菌落灰白色半透明控制方法 判定标准特征反应定性良好生长泽菌落紫黑色带金属光定性良好生长产气，硫化氢阳性斜面及底层均变黄，TSI(三糖铁琼脂)生长率定性良好生长产气，硫化氢阳性斜面及底层均变黄，定性良好生长产气，硫化氢阳性底层变黄，斜面变红，表 6非选择性分离培养基培养条件3724h控制方法定性判定标准良好生-培养基用途测试菌株特征反应营养琼生长
22、大肠杆菌脂S率ATCC25922鼠伤寒沙门菌ATCC14028c小肠耶尔森氏菌 ATCC237158.管理长(2)8.1.贮存培养基的冰箱（或冰柜）内不得存放食品、饮料等无关物品。8.2.使用前，须仔细检查培养基外观和效期，管理员应按规定的时间检查制备好的培养基的外观：如失水、沉淀、过期、棉花塞松弛或脱落等异常情况，如发现失水、沉淀等异常情况，则同一批号剩余的所有培养基及时全部弃去，不得再用8.3.对于过了效期、瓶塞松驰或脱落的培养基一旦发现立即弃去。9、记录商品化培养基/成品培养基目录清单培养基试剂入库登记表培养基配制记录培养基质量控制性能测试记录及评估报告培养基标签培养基制备用水检测记录10 引用标准10.1 GB/T27405-2008.实验室质量控制规范 食品微生物检测S.10.2 SN/T1538.1-2005.培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则S.10.3 SN/T1538.2-2007.培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测实用指南S.