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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流精品WORD文档染色法、培养基和（微生物检验）试剂配制作业指导书.精品文档.修改记录单版本时间简述A2003-11-15新发行A2004-06-02品控部改为品质部染色法、培养基和（微生物检验）试剂配制作业指导书1 目的对染色法、培养基和试剂配制方法作出明确规定，为检测结果的准确性提供最基本的保证。2 范围适用于微生物检验。3 职责 3.1微检人员负责培养基、试剂配制。3.2微检人员掌握微生物的染色方法。4 培养基和试剂配制名称、用途名称用途4.1 革兰氏染色液微生物染色4.2 营养琼脂细菌培养和细菌总数测定4.3 孟加拉红培养基霉菌、酵母菌
2、计数4.4 乳糖胆盐发酵管大肠菌群，粪大肠菌群及大肠杆菌的测定4.5 乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用4.6 三糖铁琼脂肠杆菌科细菌的生化反应筛选4.7 伊红美兰琼脂分离肠道致病菌。4.8 缓冲蛋白胨水沙门氏菌检验中的前增菌4.9 四硫酸钠煌(TTB)绿增菌液沙门氏菌检验中的前增菌4.10 GN增菌液志贺氏菌的前增菌4.11 亚硒酸盐胱氨酸增菌液沙门氏菌选择性增菌培养4.12 SS琼脂沙门氏菌、志贺氏菌的分离4.13 V-P半固体琼脂细菌检验的V-P试验4.14 7.5%氯化钠肉汤金黄色葡萄球菌的增菌培养4.15 Baird-Parker培养基金黄色葡萄球菌的检验4.16 酸性肉汤酸性罐头食品商
3、业无菌检验4.17 尿素琼脂基础细菌检验中的尿素酶试验4.18 赖氨酸脱羧酶培养基细菌检验中的赖氨酸脱羧酶试验4.19 吲哚培养基细菌靛基质试验，亦称色氨酸肉汤4.20 硝酸盐氰化钾培养基细菌检验中的硝酸盐还原试验和氰化钾试验4.21 生理盐水检样的溶解与稀释5 具体内容5.1革兰氏染色法5.1.1革兰氏染色液5.1.1.1结晶紫染色液成份： 结晶紫 1.0g95%乙醇 20.0ml1%草酸铵水溶液 80.0ml5.1.1.2革兰氏碘液成份： 碘 1.0g碘化钾 2.0g蒸馏水 300.0ml5.1.1.3 95%乙醇5.1.1.4沙黄复染液 成份： 沙黄 0.25g95%乙醇 10.0ml
4、蒸馏水 90.0ml 5.1.2染色法5.1.2.1将涂片在火焰上固定。5.1.2.2初染：滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。5.1.2.3媒染：滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。5.1.2.4脱色：滴加95%乙醇脱色，水洗；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s，水洗。5.1.2.5复染：滴加沙黄复染液，染1min，水洗，待干，镜检。5.1.2.6结果判定：革兰氏阳性菌呈紫色；革兰氏阴性菌呈红色。5.2一般培养基和专用培养基5.2.1营养琼脂5.2.1.1用途：用于一般细菌培养及细菌总数测定。5.2.2.2成份（g/L）： 蛋白胨 10.0 牛肉粉 3.0 氯
5、化钠 5.0 琼脂 15.0 PH7.30.15.2.2.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，12115 min高压灭菌备用。5.2.2.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。5.2.2孟加拉红培养基5.2.2.1用途：用于粮食、食品、饮料中霉菌、酵母菌计数。5.2.2.2成份（g/L）： 蛋白胨 5.0 葡萄糖 10.0 磷酸二氢钾 1.0 硫酸镁 0.5 孟加拉红 0.03 氯霉菌 0.1 琼脂 15.05.2.2.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，12120 min高压灭菌备用。5.2.2.4注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。5.2.3乳糖
6、胆盐发酵管5.2.3.1用途：用于大肠菌群，粪大肠菌群及大肠杆菌的测定。5.2.3.2成份（g/L）： 蛋白胨 20.0 胆盐 3.0 乳糖 5.0 溴甲酚紫 0.01PH7.40.15.2.3.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，11515min高压灭菌，双料乳糖胆盐发酵管除纯水外，其它成份加倍。5.2.3.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。5.2.4乳糖复发酵管5.2.4.1用途：供大肠菌群证实试验用。5.2.4.2成份（g/L）： 蛋白胨 20.0 乳糖 10.0 溴甲酚紫 0.01PH7.40.15.2.4.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加
7、热煮沸至完全溶解，分装10ml于有倒立发酵管的试管中，11515min高压灭菌备用。5.2.4.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。5.2.5三糖铁琼脂5.2.5.1用途：主要用于肠杆菌科细菌的生化反应筛选。5.2.5.2成份（g/L）： 蛋白胨 20.0 酚红 0.025 牛肉膏 3.0 氯化钠 5.0 乳糖 10.0 硫酸亚铁铵(6H2O) 0.5 蔗糖 10.0 硫代硫酸钠 0.5 琼脂 12.0 葡萄糖 1.0PH7.40.15.2.5.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至溶解，分装试管，11515min高压灭菌制成高层斜面备用。5.2.5.4注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光
8、。5.2.6伊红美兰琼脂5.2.6.1用途：弱选择性培养基，用于分离肠道致病菌。5.2.6.2成份（g/L）： 蛋白胨 10.0 乳糖 10.0 磷酸氢二钾 2.0 琼脂 15.0 伊红 0.4 美兰 0.065PH7.10.25.2.6.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热溶解，12115min高压灭菌，冷至55倾注平板备用。5.2.6.4注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光。实施纠正措施5.2.7缓冲蛋白胨水5.2.7.1用途：用于沙门氏菌检验中的前增菌。5.2.7.2成份（g/L）： 蛋白胨 10.0 氯化钠 5.0 Na2HPO4(12H2O) 9.0 KH2PO4 1.5最终PH7
9、.20.15.2.7.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每瓶225ml，12115min高压灭菌备用。5.2.7.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。5.2.8四硫酸钠煌(TTB)绿增菌液5.2.8.1用途：用于沙门氏菌检验中前增菌。5.2.8.2成份（g/L）：A基础培养基多胨或胨 5.0g胆盐 1.0g碳酸钙 10.0g硫代硫酸钠 30.0g蒸馏水 1000mlB碘溶液碘 5.0g碘化钾 6.0g蒸馏水 20ml5.2.8.3制法：将基础培养基的各成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装每瓶100 ml。分装时应随时震荡，使其中的碳酸钙混匀。121高压灭菌15min备用，临用
10、时每100 ml基础培养基中加入碘溶液2 ml、0.1%煌绿溶液1 ml。5.2.8.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。5.2.9GN增菌液 5.2.9.1用途：用于志贺氏菌的前增菌液5.2.9.2成份（g/L）：胰蛋白胨 20.0 g葡萄糖 1.0 g甘露醇 2.0 g柠檬酸钠 5.0 g去氧胆酸钠 0.5 g磷酸氢二钾 4.0 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5.0 g蒸馏水 1000ml5.2.9.3制法:按上述成分配好，加热使溶解，校正pH。分装每瓶225 ml，115高压灭菌15min。5.2.9.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。5.2.10亚硒酸盐胱氨酸增菌液5.2.10.1用途
11、：用于沙门氏菌选择性增菌培养。5.2.10.2成份（g/L）： 蛋白胨 5.0 乳糖 4.0 磷酸氢二钠 10.0 亚硒酸氢钠 4.0 L-胱氨酸 0.1PH7.00.15.2.10.3制法: 称取各成份溶于灭菌纯水中，在无菌容器中溶解，分装，每瓶100ml，备用。5.2.10.4注意事项：于4冰箱中密封保存。5.2.11 SS琼脂5.2.11.1用途：用于沙门氏菌、志贺氏菌的分离。5.2.11.2成份（g/L）： 蛋白胨 5.0 牛肉粉 5.0 乳糖 10.0 三号胆盐 3.5 柠檬酸铁 10.0 柠檬酸钠 8.5 中性红 0.025 硫代硫酸钠 8.5 琼脂 15.0 煌绿 0.00033
12、PH7.00.15.2.11.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸溶解，冷至55，倾注平板备用。5.2.11.4注意事项：A保存于阴凉干燥处，密封、避光。 B勿高压灭菌。5.2.12V-P半固体琼脂5.2.12.1用途：用于细菌检验的V-P试验。5.2.12.2成份（g/L）： 蛋白胨 12.0 酵母膏 1.0 葡萄糖 10.0 氯化钠 5.0 琼脂 3.0 PH7.30.15.2.12.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至溶解，分装试管，每管11.5ml，12110min高压灭菌，立即取出冷却备用。5.2.12.4配制试剂：甲液： -萘酚 6.0g 无水乙醇溶液 100.0ml乙液：
13、 氢氧化钾 40.0g 肌酸 0.3g 蒸馏水 100.0ml先将氢氧化钾溶于水中，再加入肌酸。甲液和乙液保存于4冰箱内，可使用2个月。5.2.12.5试验方法：挑取琼脂培养物接种V-P培养基中，于361培养24h2h，将甲液0.2ml（约6滴）加入试管中，摇混均匀，再加入乙酸0.1ml（约3滴），再摇混均匀。阳性反应立即或15min内呈现红色，阴性反应为铜色。阴性结果在1h后再做一次检查。有些试管在数小时后红色会逐渐消失，此仍作阳性反应。5.2.12.6注意事项：保存于阴凉干燥处，密封、避光。5.2.13 7.5%氯化钠肉汤5.2.13.1用途：用于金黄色葡萄球菌的增菌培养。5.2.13.2
14、成份（g/L）： 蛋白胨 10.0 牛肉粉 3.0 氯化钠 75.0 PH7.40.15.2.13.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每瓶50ml，12115min高压灭菌备用。5.2.13.4注意事项：密封保存于阴凉干燥处。5.2.14 Baird-Parker培养基5.2.14.1用途：用于食品中金黄色葡萄球菌的检验。5.2.14.2成份（g/L）： 胰蛋白胨 10.0 丙酮酸钠 10.0 牛肉膏 5.0 甘氨酸 12.0 酵母膏 1.0 氯化锂(6H2O) 5.0 琼脂 20.0 PH7.40.15.2.14.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至溶解，分装每瓶
15、95ml，12115min高压灭菌，冷至50时，每95ml加入5ml亚碲酸钾卵黄增菌液。5.2.14.4注意事项：A保存于阴凉干燥处，密封、避光。B平板冰箱贮存不超过48小时。5.2.15酸性肉汤5.2.15.1用途：用于酸性罐头食品商业无菌检验。5.2.15.2成份（g/L）： 多价蛋白胨 5.0 酵母粉 5.0 葡萄糖 5.0 磷酸氢二钾 4.0 PH5.00.2 5.2.15.3制法: 称取各成份溶于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装，12120 min高压灭菌备用。5.2.15.4注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。5.3生化试验培养基和试剂5.3.1尿素琼脂基础 5.3.1.1用途
16、：用于细菌检验中的尿素酶试验。5.3.1.2成份（g/L）： 蛋白胨 1.0 葡萄糖 1.0 氯化钠 5.0 磷酸二氢钾 2.0 酚红 0.012 琼脂 15.0 PH6.80.15.3.1.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，12115min高压灭菌，冷至55以无菌技术每95ml溶液加入40%尿素水溶液5ml，混匀后制成斜面备用。5.3.1.4试验方法：挑取琼脂培养物接种，在361培养24h，观察结果。尿素酶阳性者出于产碱而使培养基变为红色。5.3.1.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。5.3.2赖氨酸脱羧酶培养基5.3.2.1用途：用于细菌检验中的赖氨酸脱羧酶试验。5
17、.3.2.2成份（g/L）： 酵母膏 3.0 葡萄糖 1.0 L-赖氨酸 5.0 溴甲酚紫 0.016 PH6.70.15.3.2.3制法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管，每管1-1.5ml，12115min高压灭菌备用。5.3.2.4试验方法：从琼脂斜面上挑取琼脂培养物接种，在361培养18-24h，观察结果。赖氨酸脱羧酶阳性者出于产碱而使培养基变为紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变黄色。对照管应为黄色。5.3.2.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。5.3.3吲哚培养基5.3.3.1用途：用于细菌靛基质试验，亦称色氨酸肉汤。5.3.3.2成份（g/
18、L）： 蛋白胨 10.0 氯化钠 5.0 DL-色氨酸 1.0 PH7.40.15.3.3.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，12115min高压灭菌备用。5.3.3.4配制柯凡克试剂：对二甲氨基苯甲醛 10.0g戊醇 150.0ml浓盐酸 50.0ml将色泽鲜明干燥的对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，缓慢搅拌加入盐酸，加热至60，呈深黄色，静置6-7h，变成黄色即可使用。试剂宜少量配制，不用时保存于4冰箱内。久存后试液变成褐色不可使用。5.3.3.5试验方法：挑取琼脂培养物接种，在361培养24h，滴加柯凡克试剂0.1ml。阳性反应出现红色环；阴性反应为黄色环。5.3.3.6注意事
19、项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。5.3.4硝酸盐氰化钾培养基5.3.4.1用途：用于细菌检验中的硝酸盐还原试验和氰化钾试验。5.3.4.2成份（g/L）： 蛋白胨 10.0 氯化钠 5.0 磷酸二氢钾 0.225磷酸氢二钠 5.64 硝酸钾（无亚硝酸盐）1.0 5g/L氰化钾溶液 10.0 PH6.80.15.3.4.3用法: 称取各成份于纯水中，加热煮沸至完全溶解，12115min高压灭菌，每100ml无菌加入0.5%氰化钾溶液1ml，分装无菌试管备用；同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。5.3.4.4试验方法：挑取琼脂培养物接种，先接种于吲哚培养基中，混匀，然后灼烧接种环，再沾取吲哚培养基少许接种于氰化钾培养基中，于361培养24h，观察培养液有无混浊，培养液出现混浊，即有细菌生长，为阳性反应（不抑制）；经2天培养，细菌不生长为阴性反应（抑制）。5.3.4.5注意事项：保存于阴凉干燥处；密封、避光。5.3.5生理盐水5.3.5.1用途：用于检样的溶解与稀释。5.3.5.2成份：（g/L）： 氯化钠 8.5g 纯水 1000.0ml5.3.5.3制法：称取氯化钠于纯水中，至完全溶解，分装，121高压灭菌15min。