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1、专题1微生物的实验室培养与应用 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望 了解有关培养基的基础知识，进行无了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。菌技术的操作，进行微生物的培养。一、课题目标：一、课题目标：掌握掌握培养基的制备培养基的制备、高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌和和平平板划线法板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。行无菌操作，成功地培养微生物。无菌技术的操作。无菌技术的操作
2、。二、课题重点和难点：二、课题重点和难点：三、技能目标：三、技能目标：一、一、微生物基础知识微生物基础知识(一一)微生物微生物:1.1.特点：结构都相当简单特点：结构都相当简单,个体多数十分微小个体多数十分微小.通常要通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素且体内一般不含有叶绿素.不能进行光不能进行光合作用合作用.微生物包括五类：微生物包括五类：病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生动物原生动物 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界(二)培养基1.分类(按物理形态分
3、按物理形态分)(1)(1)液体培养基液体培养基(2)(2)固体培养基固体培养基常用的固体培养基常用的固体培养基:琼脂固体培养基琼脂固体培养基.微生物在固体培微生物在固体培养基表面生长养基表面生长,可可以形成肉眼可见的以形成肉眼可见的菌落菌落.培养基（培养液）：是培养基（培养液）：是由人工方法配制而成的，专供微生由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物生长繁殖使用的混合营养液。液。2.2.培养基内所含的基本物质培养基内所含的基本物质(4(4种种)(1)水(2)碳源(3)氮源(4)无机盐(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质-?如：培养乳酸杆菌需要
4、在培养基中添加维生素(3)氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件3.培养基内所需的其他条件培养基内所需的其他条件练习练习生长因子生长因子 小结：不同的微生物往往需要采用不小结：不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方同的培养基配方(参考教材附录参考教材附录3 3内容内容)。不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳源碳源、和和氮源氮源、无机盐无机盐、等等营养物质，另外还需营养物质，另外还需要满足微生物生长对要满足微生物生长对pHpH、特殊营养物质特殊营养物质,例例如如:生长因子生长因子(即细菌生长必需，而自身不即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物能合成的化合物,如
5、维生素、某些氨基酸、如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶嘌呤、嘧啶)以及以及氧气氧气、二氧化碳二氧化碳、渗透压渗透压等等的要求。的要求。(三)无菌技术1 1、获得纯净培养物的关键、获得纯净培养物的关键:2 2、无菌技术包括的四大方面、无菌技术包括的四大方面(参看教材参看教材1515页页)3 3、消毒与灭菌、消毒与灭菌(1)(1)消毒：消毒：概念：使用较为概念：使用较为温和温和的物理或化学方法仅杀死物体表的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。面或内部一部分对人体有害的微生物。不包括芽孢和不包括芽孢和孢子。孢子。方法方法:a.a.煮沸消毒法煮沸消毒法b.b.巴氏消毒法巴氏消毒法
6、:如牛奶的消毒如牛奶的消毒c.c.化学药剂消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等d.d.紫外线消毒紫外线消毒防止外来杂菌的入侵防止外来杂菌的入侵（2 2）灭菌）灭菌概念：使用概念：使用强烈强烈的理化因素杀死物体内外所有的微的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。生物，包括芽孢和孢子。方法：方法：a a 灼烧灭菌灼烧灭菌 b b 干热灭菌干热灭菌 c c 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌a.a.灼烧灭菌灼烧灭菌 微生物的接种工具微生物的接种工具 (接种环、接种针接种环、接种针)或或其他金属用具直接在其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼火焰的充分燃烧
7、层灼烧烧注意适用范围注意适用范围b.b.干热灭菌干热灭菌 c.c.160 160170 170；1 12h2h能耐高温的需要保持干能耐高温的需要保持干燥的物品燥的物品(玻璃器皿玻璃器皿)c.c.高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 d.d.100kPa 121 100kPa 121 e.e.15-30min15-30min通常用于培养基的灭菌通常用于培养基的灭菌思考思考二、实验操作二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基计算称量计算称量溶化溶化灭菌灭菌倒平板倒平板（二）纯化大肠杆菌（二）纯化大肠杆菌接种方法有：接种方法有：平板划线法平板划线法和和稀释稀释涂布平板法涂布平
8、板法（三）将接种后的培养基和一个未接（三）将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入种的培养基放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h和和24h24h后，观察并记录后，观察并记录三、课题延伸：菌种的保藏三、课题延伸：菌种的保藏1、斜面保藏、斜面保藏（临时保存临时保存）2、甘油保藏、甘油保藏 （长期保存长期保存）练习练习再再 见见倒平板倒平板讨论讨论:(1).培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？(2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为什么需要使锥形瓶的瓶口通
9、过火焰？(3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？(4).在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？生物吗？为什么？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠
10、，凝固后的培养基表面的答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。因此最好不要用这个平板培养微生物。1、平板划线法、平板划线法(1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
11、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？(2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？(3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线的末端开始划线？讨论讨论:答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌
12、种，使下一次划线时，接种环上线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。染环境和感染操作者。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从答：划线后，线条末端细菌的数
13、目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布法稀释涂布法:(1)系列稀释操作:涂布平板操作涂布平板操作讨论讨论:涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第想，第2步应如何进行无菌操作？步应如何进行无菌操作？提示：应从操作的各个细节保证提示：应从操作的各个细节保证“无菌无菌”。例
14、如，酒精灯。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。吸管要在酒精灯火焰周围；等等。返回返回菌落：单个或少数细菌在固体培养单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成基上大量繁殖时，就会形成一个一个肉眼可见的肉眼可见的，具有一定，具有一定形态结构的子细胞形态结构的子细胞群体群体，叫，叫做菌落做菌落。不同的细菌的菌落特征不同不同的细菌的菌落特征不同菌落是菌落是鉴定菌种的重要依据鉴定菌种的重要依据。(2)碳源碳源可作为碳源的物质有可作为碳源的物质有:a.含碳无机物含碳无机物:、b.含碳有机物：含
15、碳有机物：蛋白质蛋白质脂肪脂肪酸酸返回返回不同微生物所利用的碳源不同不同微生物所利用的碳源不同a.异养型微生物的碳源为异养型微生物的碳源为b.自养型微生物的碳源为自养型微生物的碳源为碳酸盐碳酸盐碳酸氢盐碳酸氢盐二氧化碳二氧化碳糖类（主要）糖类（主要）含碳有机物（有机碳）含碳有机物（有机碳）含碳无机物（无机碳）含碳无机物（无机碳）(3)氮源氮源可作为氮源的物质有可作为氮源的物质有:a.含氮无机物：含氮无机物：、b.含氮有机物：含氮有机物：蛋白蛋白胨胨牛肉膏牛肉膏尿素尿素返回返回固氮微生物所利用的氮源是固氮微生物所利用的氮源是氮气氮气氨气氨气硝酸盐硝酸盐氨盐氨盐氮气氮气练习1（多项选择）1、下列细
16、菌中，能利用含碳无机物作碳源的是A 光合细菌 B 根瘤菌 C 硝化细菌 D 乳酸菌2、培养大肠杆菌的培养基中，必需含有的碳源和氮源是A 糖、有机酸等 B 二氧化碳、碳酸盐C 蛋白质 D 无机氮化物3、下列叙述不正确的是A 培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质B 液体培养基和固体培养基所含的最基本物质不相同C 微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌A.CA.CB.C.思考:1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？生物污染外，还有什么目的？2)消毒和灭菌有何不同？消毒和灭菌有何不同？3)为什么消毒
17、牛奶要用巴氏消毒法为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?4)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。需要，请选择合适的方法。培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管实验操作者的双手实验操作者的双手消毒消毒灭菌灭菌条件条件温和温和强烈强烈作用作用范围范围物体表面或内部一部物体表面或内部一部分分,不包括芽孢和孢不包括芽孢和孢子子物体内外所有微生物物体内外所有微生物,包括芽孢和孢子包括芽孢和孢子无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感
18、染。灭菌灭菌 灭菌灭菌 消毒消毒营养成分不被破坏营养成分不被破坏思考思考1溶化时为什么要将牛肉膏连同称量纸一起加热?答:加琼脂的目的是什么?答:可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能可保证粘附在称量纸上的牛肉膏也能溶于水中溶于水中,减少误差减少误差作为凝固剂作为凝固剂思考思考2在灭菌前,用牛皮纸、旧报纸包紧盛有 培养基的锥形瓶的目的是什么？答:培养皿能否用高压蒸汽灭菌？答:在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞在灭菌时能避免水蒸汽凝结时浸湿棉塞,在在取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中取出培养基锥形瓶时也起到隔绝空气中杂菌污染的作用杂菌污染的作用不能不能,因为培养皿要保持干燥因为培养皿要保持干燥,应该用干
19、热灭菌应该用干热灭菌.练习练习2:1.获得纯净培养物的关键是A 将用于微生物培养的器皿.接种用具和培养基等器具进行灭菌B 接种纯种细菌C 适宜环境条件下培养D 防止外来杂菌的入侵2.下列操作与无菌技术无关的是A 接种前用肥皂洗双手,再用酒精擦拭双手B 接种前用火焰烧灼接种针C 培养在50左右时搁置斜面D 在酒精灯的火焰旁完成3.外科手术器械和罐头食品的处理,要以能够杀死什么为标准A 球菌 B 杆菌 C 螺旋菌 D 芽孢DCD 4.某学校打算开辟一块食用菌栽培基地某学校打算开辟一块食用菌栽培基地,以丰富学生以丰富学生的劳动技术课内容的劳动技术课内容,首先对食用菌实验室进行清扫和首先对食用菌实验室
20、进行清扫和消毒处理消毒处理,准备食用菌栽培所需的各种原料和用具准备食用菌栽培所需的各种原料和用具,然然后从菌种站购来各种食用菌菌种后从菌种站购来各种食用菌菌种.请回答以下问题请回答以下问题:(1)对买回来的菌进行扩大培养,首先制备试管培养基,写出制备固体牛肉膏蛋白胨培养基所需的原料 。其中提供氮源的主要 是 ；提供能源的主要物质是 ；琼脂的作用是 ，它不提供营养。(2)微生物在生长过程中对各种成分所需量不同,故制备培养基时各成分要有合适的 ,在烧杯加入琼脂后要不停地 ,防止 .牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂牛肉膏、蛋白胨、水、无机盐、琼脂牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨凝固剂凝固剂比例比例搅拌搅拌琼
21、脂糊底引起烧杯破裂琼脂糊底引起烧杯破裂(3)将配制好的培养基转移到锥形瓶中,加棉塞后包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌,压力为 ,温度为 ,时间 ,灭菌完毕拔掉电源,待锅内压力 ,将试管取出.(4)使用高压蒸汽灭菌锅时注意,先向锅内倒入 ,把锅内水加热煮沸并将基中原有冷空气彻底排除后将锅密闭.(5)从一支试管向另一支试管接种时注意,接种环要在酒精灯 焰灭菌.并且待接种环 后沾取菌种,试管口不能离开酒精灯火焰附近,将接种的试管放入 冰箱中保藏.高压灭菌锅高压灭菌锅100KPa121 自然降至零后自然降至零后 适量水适量水外外冷却冷却415-30min（1 1）按物理状态来分：培养基可分为）按物理
22、状态来分：培养基可分为固体培养基固体培养基和和液体液体培养基培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。（2 2）按功能来分，可分为）按功能来分，可分为选择培养基选择培养基和和鉴别培养基鉴别培养基。（3 3）按成分来分，可分为）按成分来分，可分为天然培养基天然培养基和和合成培养基合成培养基。培养基的类型和用途培养基的类型和用途属于选择培养基有：加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离
23、固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物 根据细胞生存所需物质的种类和根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基酸、合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。一些辅助物质。优点：优点：标准化生产，组分和含量相标准化生产，组分和含量相对固定对固定;成本低成本低 缺点：缺点：缺少某些成分，不能完全满缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。足体外细胞生长需要。合成培养基合成培养基:天然培养基有血清、血浆、和
24、组天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：优点：营养成分丰富，培养效果好营养成分丰富，培养效果好缺点：缺点：来源受限来源受限;成分复杂，影响对某成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染易发生支原体污染;天然培养基：天然培养基：血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）白、铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清）。液体培养基：液体培养基：(增菌增菌)表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长固体培养基固体培养基：（：（纯化，增菌纯化，增菌,形成形成菌落，菌苔）菌落，菌苔）