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1、实验二、酵母蔗糖酶的提取和实验二、酵母蔗糖酶的提取和酶活测定酶活测定实验目的实验目的n学习提取酵母蔗糖酶的方法；n测定蔗糖酶活力的方法。实验材料实验材料n材料：活性干酵母粉、石英砂；n试剂：95冰乙醇、DNS液、PBS（）、5蔗糖溶液、1N NaOH溶液；n仪器：水浴锅、离心机、722型分光光度计。实验原理实验原理n蔗糖酶的提取过程；n酶活的测定方法。n蔗糖酶蔗糖酶1.蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下度以下可保持酶活不变；在范围内范围内均可保持较高的酶活；2.蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化，或者加入还原剂（如Vc）保持酶活力；3.酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，
2、一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大（约270KDa），后者活力较低，分子量约为135KDa，两种酶的底物专一性和动力学性质十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶。n提取工艺提取工艺1.破碎酵母细胞的方法：破碎酵母细胞的方法：蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持低温防止酶失活；或者采用自溶法（适当的酸度和温度下利用酵母菌自身的酶系破坏细胞壁），此方法较为温和，但是时间较长，需加入少量防腐剂，防止过程中外界细菌污染；原则：原则：低温，处理时间短，防止酶失活。2.选择性热变性：选择性热变性：根据蔗糖酶的耐热性质耐热性质，将热不稳定性杂蛋白变性除去，而
3、蔗糖酶保持活性仍在上清液中；该法简便易行。原则：原则：1、选择合适的温度和加热时间合适的温度和加热时间，防止目的物变性，2、溶液的蛋白质浓度要合适蛋白质浓度要合适，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。3.有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：根据蔗糖酶的分子量和亲水性分子量和亲水性，在溶液中加入一定量的无水乙醇溶 液，利用其脱水作用脱水作用，破坏了蛋白质分子表面的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下来，而与其它杂质分开。一般采用分级沉淀法摸索目的 物沉淀的条件。原则：原则：1、注意在低温下操作低温下操作，故无水乙醇要预冷；2、边加乙醇边搅拌溶液边加乙醇边搅拌溶液，防止局部乙醇过浓，导致酶变性失活；3、离心后应迅速将上
4、清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，避免酶与避免酶与 有机溶剂长时间接触有机溶剂长时间接触，防止其变性。n测定酶活的原理测定酶活的原理1.蔗蔗糖糖酶酶可可作作用用于于1，2糖糖苷苷键键，将蔗糖水解为D葡萄糖和D果糖；Cu2+、Zn2+、Fe2+是其激活剂，Mn2+是其抑制剂。2.葡葡萄萄糖糖和和果果糖糖具具有有还还原原性性，在偏碱性条件下，可与3，5二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在在一一定定浓浓度度范范围围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。3.蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。n提取酶注
5、意事项提取酶注意事项1.了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性分子量、酸碱稳定性、热稳定性，选择合适的提取条件；2.提取过程中采用缓冲液系统溶解酶缓冲液系统溶解酶，并可添加一些保护剂（如还原剂、金属螯合剂等）；3.提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、低温、避免剧烈搅拌、强酸、强碱等变性的因素强碱等变性的因素；4.一般先选择分辨率低处理量大的方法先选择分辨率低处理量大的方法（如萃取、沉淀、吸附）浓缩酶，再采用分辨率高的方法再采用分辨率高的方法（如离子交换层析、亲和层析、超滤）精制；5.通过酶活测定，调节提取条件。实验步骤实验步骤n反复冻融法破碎酵母细胞反复冻融法破碎酵母细胞 称取活性干酵
6、母，石英砂，置于预冷的研钵中，研磨至粉状，加入10mLPBS（），混合均匀，研磨5min,20度冷冻510min，再研磨5min；n离心获得粗酶液离心获得粗酶液 吸取4mL酵母细胞破碎液于离心管（分装于4只离心管中），8000rpm 5min，保留上清液；粗酶液粗酶液n分离纯化获得纯酶液分离纯化获得纯酶液1.吸取4mL酵母细胞破碎液于烧杯中，45度水浴10min，缓慢搅拌，迅速冰浴冷却，然后分装于4只离心管中，12000rpm 10min，保留上清液；选择性热变性除去杂蛋白选择性热变性除去杂蛋白2.将上清液倒入烧杯，加入等体积预冷的无水乙醇（乙醇终浓度约50），20度静置15min，然后分装于
7、4只离心管中，12000rpm 10min，保留沉淀物；有机溶剂沉淀法获得蔗有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶糖酶3.每只离心管加入（），轻轻搅拌溶解沉淀物；纯酶液纯酶液n酶活测定酶活测定1.蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖试剂（均（均35度预度预热）热）粗酶液组粗酶液组纯酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2酶液（mL）1.01.01.01.01N NaOH液（mL）0.50.55%蔗糖液（mL）2.02.02.02.035度水浴10min，自来水冷却1N NaOH液（mL）0.50.52、DNS法测定还原糖量法测定还原糖量试剂粗酶液组粗酶液组纯酶液组纯酶液组测定组1对照组1测
8、定组2对照组2水解液（mL）1.01.01.01.0蒸馏水（mL）1.01.01.01.0DNS液（mL）1.01.01.01.0沸水浴沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零以对照组调零，记录测定组OD540nm。实验结果实验结果n计算酶活力计算酶活力 将吸光值代入还原糖标准曲线，得到水解液中还原糖的质量。（Y：吸光值；X：还原糖的质量（mg）蔗糖酶活力定义：蔗糖酶活力定义：在一定实验条件下，在规定时间内释放1mg还原糖的酶量为一个活力单位。酶活力（酶活力（U/mL）还原糖毫克数（水解液体积）（酶液体积）还原糖毫克数（水解液体积）（酶液体积）n计算蔗糖酶回收率计算蔗糖酶回收率 回收率纯酶液活力回收率纯酶液活力粗酶液活力粗酶液活力思考题思考题n简述影响蔗糖酶得率的因素。