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1、酵母蔗糖酶酵母蔗糖酶Km值的测定值的测定 目的与要求：目的与要求：学习米氏常数的测定原理及学习米氏常数的测定原理及方法，相识底物浓度对酶促反应方法，相识底物浓度对酶促反应速度的影响。速度的影响。试验原理：试验原理：影响酶促反应速度的因素有：底物浓度、影响酶促反应速度的因素有：底物浓度、酶的浓度、酶的浓度、pH值、环境温度等。当环境值、环境温度等。当环境温度、温度、pH值和酶浓度等条件相对恒定时，值和酶浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度酶促反应的初速度v随底物浓度增大而增随底物浓度增大而增大，直到酶全部被底物所饱和时达到最大，直到酶全部被底物所饱和时达到最大速度大速度Vmax。反应初速度与底
2、物浓度间。反应初速度与底物浓度间的关系可用米的关系可用米-曼氏方程式表示。将两边曼氏方程式表示。将两边取倒数，接受双倒数作图法可求得取倒数，接受双倒数作图法可求得Km值。值。操作步骤操作步骤q 干净大试管干净大试管5只编号只编号,按按 P45表加入试剂表加入试剂.混匀混匀,37 C15min.q 取出后加入取出后加入1mol/L NaOH 0.5ml,摇匀终止反应。摇匀终止反应。q 按按 P45表加入试剂表加入试剂.混匀混匀,沸水浴沸水浴5min,流水冷却，流水冷却，稀释到稀释到12.5ml.q 540nm测测 OD值。值。结果与计算：结果与计算：在横坐标上查得酵母蔗糖酶的在横坐标上查得酵母蔗糖酶的Km值。值。留意事项：留意事项：微量移液器的运用。微量移液器的运用。血糖管的运用。血糖管的运用。水浴温度、时间要精确。水浴温度、时间要精确。煮沸时留意平安。煮沸时留意平安。