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1、固定化酵母细胞及蔗糖酶的检测实验目的n n了解酶与细胞固定化方法并掌握一种酵母细胞固定化技术。n n了解蔗糖酶活力的测定原理及还原糖的定性检测法。实验原理n n固定化酶和固定化细胞是利用物理及化学的处理固定化酶和固定化细胞是利用物理及化学的处理方法，将水溶性酶或细胞与固体的水不溶性支持方法，将水溶性酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。它们在固相状态下增加保持酶和微生物的活性。它们在固相状态下增加了机械强度，稳定性提高，可回收反复使用，并了机械强度，稳定性提高，可回收反复使用，并在贮存较长时间后依然
2、保持酶和微生物的活性不在贮存较长时间后依然保持酶和微生物的活性不变。变。n n常用的固定化方法有：（常用的固定化方法有：（1 1）物理吸附法；（）物理吸附法；（2 2）交联法；（交联法；（3 3）包埋法。）包埋法。n n相对于固定化酶，微生物细胞固定化技术的优点相对于固定化酶，微生物细胞固定化技术的优点是可避免复杂的酶提取和纯化过程，也降低了成是可避免复杂的酶提取和纯化过程，也降低了成本，同时也解决了酶的不稳定性问题，操作稳定本，同时也解决了酶的不稳定性问题，操作稳定性也较好。性也较好。n n微生物细胞固定化常用的载体有：微生物细胞固定化常用的载体有：多糖类（纤多糖类（纤维素、琼脂、葡萄糖凝胶
3、、海藻酸钙、维素、琼脂、葡萄糖凝胶、海藻酸钙、K-K-角叉胶、角叉胶、DEAE-DEAE-纤维素等）；纤维素等）；蛋白质（骨胶原、明胶等）蛋白质（骨胶原、明胶等）；无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅等）。二氧化硅等）。n n蔗糖酶活力的检测原理是利用了蔗糖酶可以催化蔗糖酶活力的检测原理是利用了蔗糖酶可以催化蔗糖水解生成果糖和葡萄糖，而单糖含有游离羰蔗糖水解生成果糖和葡萄糖，而单糖含有游离羰基，具有弱还原性。某些弱氧化剂（如硫酸铜的基，具有弱还原性。某些弱氧化剂（如硫酸铜的碱性溶液，即斐林试剂）与单糖在煮沸的条件下，碱性溶液，即斐林试剂）与单糖在
4、煮沸的条件下，会有溶液的显色变化过程：浅蓝色会有溶液的显色变化过程：浅蓝色棕色棕色砖红砖红色（氧化亚沉淀，）而蔗糖不能与斐林试剂发生色（氧化亚沉淀，）而蔗糖不能与斐林试剂发生颜色反应。且葡萄糖溶液浓度越高，颜色越深。颜色反应。且葡萄糖溶液浓度越高，颜色越深。仪器和试剂n n仪器：试管、仪器：试管、2mL2mL吸管吸管2 2支、水浴锅、漏斗支、水浴锅、漏斗n n试剂：试剂：n n海藻酸钠若干克；海藻酸钠若干克；n n卡氏酵母液；卡氏酵母液；n n4%CaCl24%CaCl2；n n10%10%蔗糖液蔗糖液100mL100mL；n n斐林试剂甲、乙液。斐林试剂甲、乙液。实验步骤 n n1 1酵母细
5、胞固定化：称取海藻酸钠酵母细胞固定化：称取海藻酸钠1 1克加入克加入100ml100ml水中，微火加热溶解后冷却到水中，微火加热溶解后冷却到3030左右，将预先左右，将预先准备好的卡氏酵母液准备好的卡氏酵母液1015mL1015mL（若浓度低，可提（若浓度低，可提高加入量）加入混匀。然后倒入下边装有胶管与高加入量）加入混匀。然后倒入下边装有胶管与止血夹的漏斗中，让其慢慢滴入止血夹的漏斗中，让其慢慢滴入4%4%的的150200ml150200ml氯化钙溶液中，制成直径氯化钙溶液中，制成直径23mm23mm的球形固定化酵的球形固定化酵母。刚形成的凝胶珠应在母。刚形成的凝胶珠应在CaCl2CaCl2
6、溶液中浸泡一段时溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。表明制备的凝胶珠是成功的。将固定化酵母细胞装入玻璃柱中（柱下端口将固定化酵母细胞装
7、入玻璃柱中（柱下端口塞上棉花），从柱上端加入塞上棉花），从柱上端加入1020ml 10%1020ml 10%的蔗糖液，的蔗糖液，静止反应静止反应10min10min。控制一定的流速使水解糖液滴入。控制一定的流速使水解糖液滴入烧杯中。烧杯中。n n2 2蔗糖酶的检测：吸取上述水解液蔗糖酶的检测：吸取上述水解液2mL2mL于干净试于干净试管中，加入斐林试剂管中，加入斐林试剂2mL2mL，浸入沸水浴中约，浸入沸水浴中约12min12min，观察颜色变化。有氧化亚铜沉淀的说明，观察颜色变化。有氧化亚铜沉淀的说明蔗糖已被水解，管中有蔗糖酶的存在。以蔗糖已被水解，管中有蔗糖酶的存在。以10%10%蔗蔗糖液
8、作空白对照。糖液作空白对照。注意事项 n n1 1酵母细胞的活化：在缺水的状态下，微生物会酵母细胞的活化：在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。酵母细胞所需要的活化时间较短，处于休眠状态。酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要一般需要0.50.51 h1 h，需提前做好准备。此外，酵母，需提前做好准备。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。容器外。n n2 2加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验
9、的成败，海藻酸钠的浓度涉及到固定涉及到实验的成败，海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。可以通埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。可以通过观察凝胶珠的颜色和形状来判断：如果制作的过观察凝胶珠的颜色和形状来判断：如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。偏高，制作失败，需要再作尝试。思考题 n n1实验中海藻酸钠和氯化钙的作用是什么？n n2实验中所用的斐林试剂含有什么化学成分？它们的作用是什么？如何使用？