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1、 三、实验步骤及原理三、实验步骤及原理1、蔗糖酶的提取、蔗糖酶的提取2、蔗糖酶的纯化、蔗糖酶的纯化3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定、各纯化级别蔗糖酶的活性测定 4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定 5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响6、蔗糖酶酶促反应动力学研究、蔗糖酶酶促反应动力学研究7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量11、蔗糖酶的提取、蔗糖酶的提取(细胞破壁细胞破壁)u 自溶法破壁（本实验）自溶法破壁（本实验）干酵母粉干酵母粉溶于蒸馏水溶于蒸馏水乙酸钠乙酸钠乙酸乙酯乙酸乙酯3
2、5恒温恒温搅拌搅拌40分钟分钟35恒温过夜恒温过夜补加蒸馏水补加蒸馏水搅拌均匀，成糊状搅拌均匀，成糊状离心离心弃沉淀及脂层弃沉淀及脂层E1 记录生产厂家和批号记录生产厂家和批号 用硫酸纸封严（过夜）用硫酸纸封严（过夜）2E1用稀用稀 HAC 调调 pH至至4.5乙醇分级乙醇分级(32%乙醇饱和度乙醇饱和度)离心，离心，取上清取上清乙醇分级乙醇分级(47.5%乙醇饱和度乙醇饱和度)离心，离心，取沉淀取沉淀透析透析磷酸缓冲液磷酸缓冲液5mmol/L 5mmol/L pH6.0pH6.0 过夜过夜离心，离心，取上清取上清E2E2E3DEAE-52 离子交换层析离子交换层析E3E4Sephadex-G
3、100 凝胶层析凝胶层析 2、蔗糖酶的纯化、蔗糖酶的纯化31.1.酶的蛋白属性；酶的蛋白属性；酶的蛋白属性；酶的蛋白属性；2.2.调节酶溶解度的方法；调节酶溶解度的方法；调节酶溶解度的方法；调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀有机溶剂分级沉淀有机溶剂分级沉淀有机溶剂分级沉淀3.3.根据酶分子大小、形状不同的分离方法；根据酶分子大小、形状不同的分离方法；根据酶分子大小、形状不同的分离方法；根据酶分子大小、形状不同的分离方法；透析、凝胶层析透析、凝胶层析透析、凝胶层析透析、凝胶层析4.4.根据酶分子电荷性质的分离方法；根据酶分子电荷性质的分离方法；根据酶分子电荷性质的分离方法；根据酶分子电荷性质的
4、分离方法；离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析5.5.根据酶分子专一性结合的方法根据酶分子专一性结合的方法根据酶分子专一性结合的方法根据酶分子专一性结合的方法;酶的纯化方法酶的纯化方法42.2.调节酶溶解度的方法；调节酶溶解度的方法；调节酶溶解度的方法；调节酶溶解度的方法；酶的纯化方法酶的纯化方法（1）改变离子强度；）改变离子强度；盐溶盐溶/盐析盐析 硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀（反抽提法）（反抽提法）（2）改变）改变pH或温度；或温度；（3）改变介电常数；）改变介电常数；有机溶剂分级沉淀：有机溶剂分级沉淀：有机溶剂分级沉淀：有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，
5、向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。亲亲水水性性有有机机溶溶剂剂加加入入溶溶液液后后降降低低介介质质的的介介电电常常数数，使使溶溶质质分分子子之之间间的的静电引力增加，聚集形成沉淀。静电引力增加，聚集形成沉淀。亲亲水水性性有有机机溶溶剂剂的的水水合合作作用用降降低低了了自自由由水水的的浓浓度度，压压缩缩了了表表面面水水化化膜膜的厚度的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。，降低其亲水性，导致脱水凝集。5 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制有机溶剂分级沉淀操作条件的控制有机溶剂分级沉淀操作条件的控制有机溶剂分级
6、沉淀操作条件的控制 溶剂选择溶剂选择 常用的溶剂是常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。温度温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。样品浓度的控制样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2%为好。为好。63.3.根据酶分子大小、形状不同
7、的分离方法；根据酶分子大小、形状不同的分离方法；根据酶分子大小、形状不同的分离方法；根据酶分子大小、形状不同的分离方法；酶的纯化方法酶的纯化方法（1）离心分离；）离心分离；（2）透析、超滤；）透析、超滤；（3）凝胶层析）凝胶层析（gel chromatography）凝胶层析的定义：凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 凝胶层析凝胶层析 常见名称：常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析凝胶过滤、分
8、子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。7 凝胶层析的基本凝胶层析的基本原理原理l 凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是一种方法，其原理是分子筛效应分子筛效应分子筛效应分子筛效应，混合样品如同，混合样品如同“过过筛筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。一样，因分子大小的不同得以彼此分开。l在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最颗粒内部的
9、多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。后流出柱外。84.4.根据酶分子电荷性质的分离方法；根据酶分子电荷性质的分离方法；根据酶分子电荷性质的分离方法；根据酶分子电荷性质的分离方法；酶的纯化方法酶的纯化方法 离子交换层析离子交换层析基本原理基本原理：以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。在介质中带正电的物质用阳离子交换剂；带负电物质用在介质中带正电的物质用阳离
10、子交换剂；带负电物质用阴离子交换剂阴离子交换剂93、蔗糖酶的活性测定、蔗糖酶的活性测定酶活力酶活力(enzyme activity)酶催化某一反应的能力酶催化某一反应的能力VV单位时间内单位体积中单位时间内单位体积中 底物底物(substrate)的减少量的减少量或或 产物产物(product)的增加量的增加量10国际单位（国际单位（IU）：）：在特定的条件下，每分钟催化在特定的条件下，每分钟催化1mol 底物转化为产物所需的酶量。底物转化为产物所需的酶量。催量单位（催量单位（kat）：）：在特定条件下，每秒钟使在特定条件下，每秒钟使1mol底物转底物转 化为产物所需的酶量。化为产物所需的酶量
11、。1 IU=16.6710-9 katuu 酶活力单位：酶活力单位：2、酶活力和比活力表示方式、酶活力和比活力表示方式 11活力活力(或总活力或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而涉及在样品中酶的总单位，而比活力比活力是酶纯度的量是酶纯度的量度，度，是每毫克酶的催化活力数是每毫克酶的催化活力数(U/mg蛋白蛋白)。在酶的纯化过程中它的在酶的纯化过程中它的比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。u 酶的比活力酶的比活力(specific activity，也称比活性），也称比活性）比活力：比活力：指每指每mg蛋白质所具有的酶活力蛋
12、白质所具有的酶活力，一般用，一般用U/mg蛋白质蛋白质来来表示。表示。比活力比活力=酶活力（酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml）比活力有时也可用每比活力有时也可用每g或每或每ml 酶含多少个活力单位来表示酶含多少个活力单位来表示12 DNS 法测定蔗糖酶活力（本实验）法测定蔗糖酶活力（本实验）1、3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理：二硝基水杨酸比色定糖的原理：DNS试剂试剂 +D-葡萄糖葡萄糖 氨基化合物氨基化合物 （还原糖）（还原糖）强碱性溶液强碱性溶液 沸水浴沸水浴（棕红色）（棕红色）2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可在一定范围内还原糖的量与
13、反应液的颜色强度成一定比例关系（可于比色测定），所以可用于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。比色法测定还原糖的含量。1）2、蔗糖酶活力测定的原理：蔗糖酶活力测定的原理：1）蔗糖酶催化的反应是：）蔗糖酶催化的反应是：2）蔗蔗糖糖酶酶活活力力的的规规定定：在在本本实实验验条条件件下下，每每3分分钟钟释释放放1毫毫克克还还原原糖糖所所需需的的酶量定义为一个活力单位。酶量定义为一个活力单位。(附附1)3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。蔗糖蔗糖 D-果糖果糖+D-葡葡萄糖萄糖蔗糖酶蔗糖酶13 3、DNS比色定糖法
14、工作曲线的制作：比色定糖法工作曲线的制作：取取8支支血血糖糖管管编编号号1-8，按按下下页页表表中中的的顺顺序序和和数数量量加加入入葡葡萄萄糖糖标标准准溶溶液液（2mg/ml）、蒸蒸馏馏水水、3,5-二二硝硝基基水水杨杨酸酸试试剂剂，混混匀匀后后同同时时放放入入沸沸水水浴浴中中准准确确反反应应5分分钟钟（注注意意：一一定定等等沸沸水水浴浴锅锅中中的的水水沸沸腾腾后后再再放放入入试试管管，且且不不要要用用大大烧烧杯杯代代替替沸沸水水浴浴锅锅），取取出出后后立立即即用用流流动动的的冷冷水水冷冷却却，加加蒸蒸馏馏水水定定容容至至25ml，摇匀，测定，摇匀，测定540nm处的吸光度值。处的吸光度值。以
15、以葡葡萄萄糖糖(mg)含含量量为为横横坐坐标标、A540值值为为纵纵坐坐标标，画画出出工工作作曲线。曲线。14蔗糖酶活力的测定：蔗糖酶活力的测定：操作：操作：取两支试管分别加入用 的醋酸缓冲液适当稀释过的酶液酶液 2ml，一支中加入 1mol/L的 NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管；把两支试管和 5%的蔗糖溶液放入 35 水浴中预热恒温；分别取 2ml 5%的蔗糖蔗糖加入上述两试管中，并准确计算时间时间，3 分钟后于测定管中加入 0.5ml 1mol/L 的 NaOH，摇匀，终止反应。从反应混合物中取出溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基水扬酸试剂和水，摇匀。于沸水浴
16、中准确反应5min，立即用冷水冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测光密度。在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力：E=(葡萄糖葡萄糖mg数数(4.5/0.5)E的稀释倍数的稀释倍数/2ml)/215紫紫 外外 吸吸 收收 法法双双 缩缩 脲脲 法法Folin-酚法酚法 (Lowry法法)4、蔗糖酶的蛋白浓度测定、蔗糖酶的蛋白浓度测定16 这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一，由于方法简便，灵敏度高，常为实验室所采用，也是文献上用得最多的方法之一。Folin-酚法酚法 (Lowry法法)(A)凡含有两个及两个以上肽键(-CO-NH-)的化合物在碱
17、性溶液中(如 Folin-甲试剂)都能与 Cu2+作用，形成紫色的复合物；(B)所有的蛋白质均可与 Folin-甲试剂反应形成紫色的铜-蛋白质复合物；(C)铜-蛋白质复合物在 pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸(Folin-乙 试剂)还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅(在一定范围内)与蛋白质的含量成正比。干扰物质干扰物质与双缩脲法相同，而且受它们的影响更大。（附（附2）原理原理:17三种蛋白质测定方法比较三种蛋白质测定方法比较18正交试验设计正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究是研究多因素多水平多因素多水平的一种设计方法，它是从全面
18、试验中的一种设计方法，它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了了“均匀分散，齐整可比均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是的特点，正交试验设计是分式析分式析因因设计的主要方法。设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。称为正交表。5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响196、蔗糖
19、酶酶促反应动力学研究、蔗糖酶酶促反应动力学研究 酶促反应动力学是研究酶促反应的速度酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要内容。程研究中的一个重要内容。201 1、影响酶促反应速度的因素、影响酶促反应速度的因素u pH值值u 温度温度u 酶浓度酶浓度u 底物浓度底物浓度u 激活剂激活剂u 抑制剂抑制剂21 2 2、酶促反应动力学方程式、酶促反应动力学方程式米氏学说米氏学说S：底物浓度底物浓度m：米氏常数米氏常数Vmax：最大反应速度：最大反应速度V：不同不同S时的反应速度时的反应速度Michaelis L
20、and Menten ML.,.Biochem Z.1913,49:333369.22u 米氏常数（米氏常数（Km）的意义）的意义 Km值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓度无关。浓度无关。Km值作为常数只是对一定的底物、一定的值作为常数只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度、一定的温度条件而言，测定酶的条件而言，测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。值可以作为鉴别酶的一种手段。1/Km可以表示酶对底物亲和力的大小可以表示酶对底物亲和力的大小,1/Km越大越大,表明亲表明亲和力越大和力越大,多底物酶有不同的多底物酶有不同的 Km
21、值值,最适底物的最适底物的Km值最小。值最小。233 3、抑制剂对酶活性的影响、抑制剂对酶活性的影响使酶的活性降低或丧失的现象，称为使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂抑制剂。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。24u 抑制剂的作用方式抑制剂的作用方
22、式 不可逆抑制不可逆抑制 抑制剂与酶反应中心的活性基团以抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式共价形式共价形式共价形式结合，引起结合，引起酶的永久性失活。酶的永久性失活。可逆抑制可逆抑制 抑制剂与酶蛋白以抑制剂与酶蛋白以非共价方式非共价方式非共价方式非共价方式结合，引起酶活性暂时性结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制抑制和非竞争性抑制)25 可逆抑制可逆抑制(1
23、)竟争性抑制竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。加入竞争性抑制剂后，加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反应变大，酶促反应Vmax不变。不变。26酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降
24、。由于这类物质酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。加入非竞争性抑制剂后，加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，但由于不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下减小，所以酶促反应速度也下降了。降了。可逆抑
25、制可逆抑制(1)非竟争性抑制非竟争性抑制275、蔗糖酶米氏常数的测定（本实验）、蔗糖酶米氏常数的测定（本实验）1）将离子交换柱层析得的）将离子交换柱层析得的E3稀释稀释(pH4.6 HAC缓冲液缓冲液)至至30U/mL，共，共16ml。2）取试管）取试管8支，按支，按07编号，编号，0为对照管。为对照管。3）按）按P146页表将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于页表将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35水浴中保温水浴中保温（使温度平衡，以下同）（使温度平衡，以下同）10min。4）取）取16ml酶液，放入同一水浴中保温约酶液，放入同一水浴中保温约10min。5）于各管中依次按同样时间间隔
26、加入已保温过的酶液）于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。，记时，立即摇匀。在在35水浴中准确反应水浴中准确反应3min。6）按同样次序和时间间隔，加入的）按同样次序和时间间隔，加入的1mol/L NaOH，摇匀，终止反应。，摇匀，终止反应。7）吸取反应混合物，加入盛有）吸取反应混合物，加入盛有3ml DNS试剂和去离子水的血糖管中，放入沸试剂和去离子水的血糖管中，放入沸水中加热水中加热5min，冷却后稀释定容至，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定，摇匀后，测定A540值值287、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳Sodium Dodecyl Sul
27、fate,Polyacrylamid Gel Sodium Dodecyl Sulfate,Polyacrylamid Gel Electrophoresis,Electrophoresis,SDS-PAGESDS-PAGE29电泳：电泳：是指带电粒子在电场的作用下，发生定向是指带电粒子在电场的作用下，发生定向 泳动的现象。泳动的现象。电泳技术：电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。析的技术。电泳？电泳？30 蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸
28、残形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子,在在电场下向自身电荷相反的方向移动。电场下向自身电荷相反的方向移动。313.按比例配好分离胶按比例配好分离胶,用移液枪快速加入，距梳齿下缘约用移液枪快速加入，距梳齿下缘约1cm，之后加少，之后加少许蒸馏水，静置直到胶与水层间出现清晰界面。许蒸馏水，静置直到胶与水层间出现清晰界面。加速剂加速剂TEMED要在要在注胶前加入注胶前加入，否则凝结无法注胶。，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封
29、的目的是为了使分离胶胶面平整，并排除气泡。水封的目的是为了使分离胶胶面平整，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶，连续平稳加按比例配好浓缩胶，连续平稳加 入浓缩胶至短玻璃板上缘处，迅速插入样梳入浓缩胶至短玻璃板上缘处，迅速插入样梳,静置直到胶凝好。静置直到胶凝好。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。实验过程实验过程325.在上槽内加入电极缓冲液，拔出样梳。在上槽内加入电极缓冲液，拔出
30、样梳。要使锯齿孔内的气泡全部排出，保证电流通畅。要使锯齿孔内的气泡全部排出，保证电流通畅。6.用移液枪距槽底三分之一处加样。加样前用移液枪距槽底三分之一处加样。加样前,样品在沸水中加热样品在沸水中加热3分钟，去分钟，去掉亚稳态聚合。掉亚稳态聚合。进样要缓慢，不要使样品漂出泳道外面。进样要缓慢，不要使样品漂出泳道外面。移液枪不可过低移液枪不可过低,以防刺破胶体以防刺破胶体,也不可过高也不可过高,在样下沉时会发生扩散。在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样。最好选用中部的孔注样。实验过程实验过程337.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在电泳槽中
31、加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，时，停止电泳。停止电泳。8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，将上样槽的电极缓冲液倒入指凝胶板剥离与染色：电泳结束后，将上样槽的电极缓冲液倒入指定容器，取下电泳胶玻璃板，用楔形工具小心将玻璃板撬开，将凝定容器，取下电泳胶玻璃板，用楔形工具小心将玻璃板撬开，将凝胶板和溴酚蓝染料区带中心做好标记。切除浓缩胶并冲洗后放入大胶板和溴酚蓝染料区带中心做好标记。切除浓缩胶并冲洗后放入大培养皿内，加入染色液，染色培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。小时左右。剥胶时要小心剥胶时要小心,保持胶完好无损保持胶完好无损,染色要充分。染色要充分。9.脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较直到蛋白质区带清晰，确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不同纯化过程对杂蛋白去除情况。不同纯化过程对杂蛋白去除情况。实验过程实验过程34