基因工程5页复习进程.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精,善益求善。基因工程5页-基因工程复习指导第一章绪论1、基因:就是存在于DNA上承载遗传信息的核苷酸序列,是位于染色体上呈直线排列的遗传物质的最小单位,也是携带遗传信息的结构单位和控制遗传性状的功能单位。2、基因工程:又称重组DNA技术,分子水平进行遗传操作,将任何生物体(供体)的基因或基因组提出来,或通过人工合成的目的基因,按照先设置好的蓝图,插入质粒或病毒复制子(载体),而形成一杂合分子(DNA重组体),然后将重组体转移到复制子所属的宿主生物体复制,或转移到另一生物体(受体)的细胞内(原核或真核),使之在受体细

2、胞内遗传并使受体细胞获得新的性状。3、基因工程的三要素:供体、载体、受体4、基因工程的基本流程:(1)DNA的制备包括从供体生物的基因组分离或人工合成,以获得带有目的基因的DNA片段。(2)在体外通过限制性核酸内切酶分别分离得到的外源DNA和载体分子进行定点切割,使之片段化或线性化(3)在体外将含有外源基因的不同来源的DNA片段通过DNA连接酶到载体分子上,构建重组DNA分子。(4)将重组DNA分子通过一定的方法引入到受体细胞进行扩增和表达,从培养细胞中获得大量细胞繁殖群体。(5)筛选和鉴定转化细胞,剔除非必需重组体,获得引入的外源基因稳定高效表达的基因工程菌或细胞,即将所需要的阳性克隆挑选出

3、来。(6)将选出的细胞克隆的基因进一步分研究,并设法使之实现功能蛋白的表达。第三章基因工程工具酶1、基因工程中常用的工具酶:限制酶、连接酶、聚合酶、修饰酶2、细菌的限制修饰系统(简称RM体系):细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶,构成了寄主控制的限制修饰系统R-M体系说明的问题和作用:R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA,为避免自身DNA的降解,细菌可以修饰(甲基化酶)自身DNA,未被修饰的外来DNA则会被降解。个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰,则可免予被降解。3、限制性内切酶的切割方式(识别哪种末端)(1)平齐末端:(切割位点在识别序列中心轴处

4、)(2)5黏性末端:(DNA片段末端的5端比3端长)(3)3黏性末端:(DNA片段末端的3端比5端长)4、判断同裂酶和同尾酶(1)同裂酶:来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割,形成同样的末端。如:Hpa和Msp均可切割CCGG。(2)同尾酶:来源不同,识别的核苷酸靶序列也不相同,但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。如BamH、Bcl和Bgl5、限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算举例:识别序列ADNA分子各种可能出现的序列为A、G、C、T则识别序列出现的几率为1/4(1/4n,n为识别序列的个数)6、DNA连接酶(不是概念题)DNA连接酶能利用N

5、AD+或ATP中的能量,催化多段DNA的3羟基和5磷酸末端之间形成3,5磷酸二酯键。7、DNA聚合酶聚合作用5-3外切酶活性3-5外切酶活性5-3DNA聚合酶+Klenow片段+T7DNA聚合酶+反转录酶+TaqDNA聚合酶+具有标记探针的酶:DNA聚合酶、Klenow片段第四章基因操作的主要技术一、核酸的提取1、碱裂解法抽提质粒DNA原理:在PH值介于12.012.5的条件下加热DNA溶液,线性DNA会变性,而闭合环状DNA不会变性,若用至冷的或恢复中性的方法处理DNA混合物,质粒DNA能迅速而准备的复性,但随性断裂发生的线性染色体DNA分子彼此已经分开的互补链之间的复性作用就不会那么迅速而

6、准确,往往聚集形成网状结构,与变性的蛋白质及RNA一道被离心沉淀下来,可用酒精沉淀法收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA.2、琼脂糖凝胶电泳影响其迁移率的因素:DNA的分子大小琼脂糖浓度DNA分子的构象电源电压嵌入染料的存在离子强度影响电场方向3、聚合酶链式反应(PCR):定义:基本原理:PCR是一种体外核酸扩增技术,是以待增的DNA为模板,在体外由引物介导的酶促反应特异DNA片段的方法,目的基因DNA在高温(940C)下解链成为单链模板,人工合成的一对目的基因两侧序列向互补的寡聚核苷酸引物在低温(40600C)分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合,在中等温度(65750C)下

7、由耐热DNA聚合酶(Taq酶)将dNTP中的脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端,并以此为起点,沿着模板以5-3方向延伸,合成一条新的互补链,经变性、退火、延伸三个步骤反复循环,使DNA扩增。DNA的体外复制包括3个步骤:变性(denaturation):94C退火(annealing):40C60C延伸(extension):72CPCR体系的主要组分:DNA模板、引物、底物dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液4、测序方法Sanger双脱氧链终止法(P83注意该法的图样,能识别序列,知道序列是怎样得到)原理:DNA复制:模板DNA、DNA聚合酶、引物、4种dNTPddNTP的加入:在反应系

8、统中加入双脱氧(碱基)核苷三磷酸(ddNTP),只要双脱氧核苷酸掺入3端,该链就停止延伸,链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延伸。如此得到3端终止于ddNTP的一系列长度不等的核酸片段4个反应体系中分别加入4种不同的ddNTP,浓度低于dNTP。反应终止后,分四个泳道进行电泳(聚丙烯酰胺凝胶),分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基),根据片段3端的双脱氧碱基,可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。5、基因文库:是指某种生物的全部基因的随机片断的重组DNA的克隆群体6、cDNA文库:是生物体某一特定发育时期所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成克隆的集合。7、基因文库

9、与cDNA文库的区别:cDNA文库具有时效性,是某一个发育时期,特定环境下,mRNA上信息的体现,不含有内含子序列及其他调控序列。cDNA文库只反映mRNA的分子结构,cDNA中不含有真核基因的间隔序列及调控区,cDNA并不真正意义上的基因。基因组文库可真实的显示基因组的全部遗传信息。8、基因文库构建的基本程序:DNA提取及片段化,或是cDNA的合成。载体的选择和制备。DNA片段或cDNA与载体连接。重组体转化宿主细胞。转化细胞的筛选。9、考虑基因文库的完备性(P表示某一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率,f代表克隆片段的平均大小与生物基因组的大小比值)P8810、(1)DNA与蛋白质相互

10、作用的方法:凝胶阻滞法、DNase足迹法(2)蛋白质与蛋白质相互作用的方法:酵母双杂交技术、噬菌体表面呈现技术第五章基因工程载体1、克隆载体必须具备的条件:在宿主细胞内能够自主复制具备合适的单一酶切位点有一定的选择标记较高的拷贝数具有较高的稳定性2、质粒克隆载体的构建(1)pBR322质粒大小为4361bp,含有30多个单一位点,具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr),其质粒复制区来自pMB1。利用四环素抗性基因内部的BamH位点来插入外源DNA片段,可通过插入失活进行筛选。(2)pUC18和pUC19(1)pUC18和pUC19大小只有2686bp,是最常用的质粒载体

11、,由pBR322改造而来,具有氨苄青霉素抗性基因,一个复制起始点,复制子为ColEI(2)两者的差异:这两个质粒的结构只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的rop基因,因此其拷贝数达500-700。3、蓝白斑筛选:载体上有一段-半乳糖苷酶(LacZ)的片段(氨基酸),其上有外源DNA的插入位点(不破坏读码框)。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因(片段缺失)。可以被IPTG(含硫的乳糖类似物)诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。通过在培养基中涂X-gal即可筛选。P1634、(1)几种克隆载体:噬菌体载体、

12、Cosmid克隆载体、M13噬菌体克隆载体(2)以上克隆载体的在载量:噬菌体载体:48kbCosmid克隆载体:45kbM13噬菌体克隆载体:1.5kb5、Cosmid克隆载体(结构)(1)柯斯质粒是由噬菌体DNA的cos位点序列和质粒的复制子所组成,具有质粒和噬菌体的双重特征。所以称为cosmid.意思是指带有黏性末端cos的质粒。6、大分子DNA克隆载体(1)酵母人工染色体(YAC):YAC的结构着丝粒(CEN)端粒(TEL)酵母ARS序列酵母选择标记第六章目的基因的分离与克隆1、基因的分离和克隆的步骤选择富含目的基因的生物试料选择合适的方法制备DNA片段并克隆选择合适的方法筛选目的基因。

13、2、目的基因的间接克隆(1)依据基因部分序列信息获取基因全长序列的策略5RACE、在反转录酶的作用下,以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成、RNase混合物降解模板mRNA,纯化cDNA第一条链。、用末端转移酶在cDNA链3端加入连续的dCTP、以连有oligo(dG)的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增,以期得到目的片段,并可用nestPCR进行检测。3RACE、是在反转录酶的作用下,以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。、用RNaseH降解模板mRNA。、用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR

14、扩增得到目的3片段,并可用nestPCR的方法继续进行检测和扩增。3、问题:基于EST系列用5RACE、3RACE求全长)P139EST可结合PCR技术进行基因克隆。经电子杂交筛选后的EST及其延伸产物序列可作为某一基因的标签,并进一步克隆新的基因。首先依据该标签序列提供的信息设计并合成基因特异引物(GSP),在对mRNA进行反转录的同时加上锚定引物,然后采用RACE技术求全长。4、基因文库的构建的过程高分子量染色体DNA的制备;体外重组边接;包装蛋白的制备;重组体的体外包装;将重组DNA导入寄主细胞;筛选第七章基因的体外重组和转化1、DNA片段的体外连接方式:黏性末端的连接、平头末端的连接、

15、修饰黏性末端的连接2、衔接物连接法原理(148149):衔接物是指用化学方法合成的一段由812个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。3、感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为容易接受外源DNA分子进入的状态,处于这种状态的细胞称为感受态细胞。第八章重组体的筛选和鉴定1、重组体的筛选:遗传学检测法、DNA电泳法检测、核酸分子杂交检测、免疫化学类检测法、转译筛选法2、插入失活筛选原理:外源DNA插入载体特定部位(一般为抗性基因或选择性标记基因),引起载体原有功能改变;例子(P160-161)以质粒pBR322介导的重组

16、子筛选:质粒pBR322编码有两个抗生素抗性基因,一个四环素抗性基因和一个抗氨苄青霉素基因,如果外源DNA片段插入pBR322的BamH位点,则在破坏了Tetr的表达,重组质粒不在具有四环素抗性,而只具有氨苄青霉素抗性。重组质粒转化的细菌在含有Amp的选择培养基固体平板上能够生长,但不能在含有Tet的培养基上生长。将转化细菌涂布培养在Amp培养基固体平板上后,能够生长的菌落则具有Amp抗性,表明这些细菌中含有pBR322质粒,说明转化成功。而没有转入质粒pBR322的细菌由于没有Amp抗性,不能在Amp培养基上能生长。3、DNA电泳法检测包括酶切鉴定和PCR检测4、核酸分子杂交检测原理:具有一

17、定同源性的两条核酸单链在适宜的温度及离子强度条件下,按碱基互补配对复性形成双链。5、免疫化学检测方法:放射免疫法、免疫沉淀法(有大题就是利用以上方法进行筛选重组子至少两种或两种以上)第九章克隆基因的表达与产物的检测1、克隆基因在原核细胞中的表达调控(了解)2、穿梭载体:是指能够在两类不同宿主细胞中复制、增殖的载体。主要是质粒载体。3、克隆基因在真核细胞中的表达调控真核生物基因表达调控的层次:(具体怎么调控自己整理)(重要题)、DNA水平调节、转录水平调节、转录后水平的调节、翻译水平的调控、翻译后水平调节4.转化植物的方法:农杆菌介导、基因枪、花粉管通道、超声波、子房注射等。题型:名词解释(53)填空(151)单选(102)简答(45)综合题(215)-

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