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1、-基因工程的工具酶-第 5 页基因工程的工具酶n 限制性核酸内切酶n DNA连接酶n DNA聚合酶n 碱性磷酸酶n 末端脱氧核苷酸转移酶限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定防御机制: n 任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制 n 人：免疫系统 n 细菌：限制与修饰系统 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自
2、身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。限制酶 (restriction enzyme)修饰酶 (modifying enzyme)核酸酶切位点：既可以在3,5-磷酸二酯键的3酯键处（A），也可以在5酯键处（B）切断磷酸二酯键1） 核酸限制性内切酶的类型2） 核酸限制性内切酶的基本特性3） 同裂酶和同尾酶4） 核酸限制性内切酶的命名法5） 影响核酸限制性内切酶活性的因素限制性核酸内切酶的类型及特性按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同，分为三类： 型 型* 型第
3、一类（I型）限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序 并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链 但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的 这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因 如：EcoB、EcoK等第二类(II型)限制性内切酶： 能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序） 并在该顺序内的固定位置上切割双链 是DNA重组技术中最常用的工具酶之一 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同n 切割后形
4、成具有粘性末端（cohesive end）的DNA片段n 切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段限制酶在识别序列的对称轴上切割，形成的DNA片段没有突出的单链第三类（ III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端，因此不能应用于基因克隆同裂酶和同尾酶n 同裂酶（同切酶或异源同工酶） ： 两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不
5、能。 例如： Hpa和Msp的识别顺序都是CCGG 如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割n 同尾酶： 有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶 可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点 如：Xba1、Nhe1以及Spe1切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即 Bfa1的酶切位点限制性核酸内切酶的命名法n 取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如
6、果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示n EcoR I E: 表示大肠杆菌属名第一个字母 co: 表示种名头两个字母 R: 表示菌株名 I: 表示该菌中第一个被分离出来的酶影响核酸限制性内切酶活性的因素n 反应的温度n DNA的纯度n 溶液中离子浓度及种类n 缓冲液的pH值n 酶切时间n DNA的分子结构限制性内切酶在保温过程中的活性变化（图解）反应体系n 10 X Buffern DNAn 酶n H2O注意酶的浓度：并不是加得越多越好！根据DNA的量选取合适的酶量1个酶单位：以20L反应体系中反应1小时，使1 g DNA完全消化所需要的酶量DNA末端长度对限制酶切割的影响n 限
7、制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说，在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则很难发挥切割活性n 限制性内切酶的Star activity 是指当酶的反应条件改变时，其在识别序列以外的位点进行切割修饰酶-甲基化酶又称甲基转移酶（methyltransferase)在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶实验室里大部分大肠杆菌菌株含有3个位点特异的甲基化酶:n Dam甲基化酶,由dam基因编码,将S-腺苷甲硫氨酸的甲基基团转移到GATC中A的N6位置上n Dcm甲基化酶,由dcm基因编码,以前称Mec甲基化酶,在C5位置修饰CCAGG和CCTGG的胞嘧啶(C)残基, 位
8、点256-512bp出现一次n EcoK I甲基化酶,识别AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中的A的N6位置，位点少,约8 kb出现一次n Sss I甲基化酶从某种Dam + 或Dcm +的菌株中分离的DNA可能抗从自身分离的限制性内切酶的切割 例如: Mbo I 和Sau 3A I识别序列GATC 从Dam+大肠杆菌中分离到的DNA完全不受 Mbo I 的切割, 但是不抗Sau 3A I来自原核生物螺原体（Spiroplasma sp.），可使CG序列中的C在C5位置上甲基化 Sss I甲基化的DNA受中mcrA, mcrBC和mrr系统的限制许多酶对此甲基化酶敏感，如：Aa
9、t II, Cla I, Xho I, Sal I如果将外源DNA引入一个大肠杆菌的宿主,它可能会受宿主细胞中的限制系统的袭击因此, 消除大肠杆菌重组分子宿主菌株中的限制系统具有重要意义（大肠杆菌的所有限制系统都集中在一个长约14 kb的迁移控制区内）某些菌株在这些基因中的某个上携带突变 如: DH5菌株在hsdS基因内有突变, 因此是EcoK I内切酶缺陷型的 普遍应用的菌株HB101是整个迁移控制区都缺失,因此缺乏所有的限制活性DNA连接酶：在体外将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子T4 DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶反应体系n 5 X Buffer (10 X Buffer )n
10、 Vectorn DNA Fragmentn T4 DNA Ligasen H2O连接反应的温度n 平末端 16 4-16 hourn 粘性末端 16 3 hour or 4 16 hourDNA聚合酶不同种类的DNA聚合酶在DNA的复制和修复中起到重要的作用n 大肠杆菌DNA聚合酶In Klenow 大片段n 耐热 DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I的酶活性： 1） 53 DNA聚合酶活性 2） 53 DNA外切酶活性（ 5端降解） 3） 3 5 DNA外切酶活性（纠错）Klenow 大片段： 大肠杆菌DNA聚合酶I 经蛋白酶处理后产生的大片段活性： 1）53 DNA聚合酶活性 2）3 5
11、DNA外切酶活性（纠错）耐热 DNA聚合酶 来自于嗜高温的细菌， 主要用于PCR反应 如：TaqDNA聚合酶 Vent DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶 Pwo DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶碱性磷酸酶n 去除5磷酸基团n 底物: DNA、RNA、脱氧核糖核苷三磷酸n 应用： a. 5端标记之前的处理b. 处理克隆载体防止载体自连 c. 外源DNA片段的末端处理防止片段间的连接目前常用的有两种：细菌碱性磷酸酶（BAP），耐高温，不易失活，要终止和灭活它很困难小牛肠道碱性磷酸酶（CIP），可在65加热45min灭活，活性高，因此更为常用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）n 从小牛胸腺中分离纯化出来的特点：（1）不需要DNA模板 （2） 沿着53方向将脱氧核苷酸加到DNA链的3羟基末端n 应用：（1）催化DNA的3末端添加同聚物 （2）DNA的3末端标记琼脂糖酶（agarase）n 是一种琼脂糖水解酶n 可以将琼脂糖亚单位水解为新琼脂寡糖n 用于从低熔点琼脂糖中分离纯化大片段DNA或RNA片段n 对热稳定，反应时不需要缓冲液