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1、精选优质文档-倾情为你奉上基因工程一、名词解释1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3.DNA重组：是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。 4.克隆：科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。 5.DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质同源或异源、原核或真核、天然或人工
2、的DNA与载体DNA相结合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。 5. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。9.基因工程：在体外把核酸分子（DN
3、A的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。10. 5RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5端之间未知序列的方法。11.cDNA library:cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。12.载体：能载带微量物质共同参与某种化学或物理过程的常量物质，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移
4、至受体的一种能自我复制的。三种最常用的载体是细菌、和动。13.基因诊断：又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。14.限制性核酸内切酶：是由细菌产生的一类能特异识别双链DNA中的特定碱基序列，并在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶)。 15.基因文库：将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。 16.cDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的mRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后导入受
5、体菌内，扩增，构建cDNA文库。 17.RFLP：RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。 18.核酸探针：是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。 19.Shuttle plasmid vector穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。20.限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来
6、保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外来DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护自身的DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。21.星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。二、简答题1.载体的分类按功能分：克隆载体：（主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。具有强大的包装能力） 表达载体：（带有目标细胞识别的启动子） 其他载体：（整合载体、穿梭载体等） 按进入受体细胞类型分（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体按来源分： 质粒（细菌等原核生物染色体
7、外遗传物质） 噬菌体（原核细胞的病毒） 真核病毒（真核细胞的病毒） 人工遗传物质（噬菌粒、粘粒、细菌、酵母等）2、基因克隆载体必备条件：1）具有多种单一核酸内切酶切割位点（多克隆位点）一个或多个)外源DNA插入，不影响载体复制。2）能携带外源DNA片段进入受体细胞能自我复制，或整合到染色体随受体细胞DNA复制而复制。3）有选择克隆子的标记基因（筛选标记）。4）分子量小，拷贝数高，易从宿主细胞中分离。5）安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞)。 3、表达载体和基因工程一般克隆载体在元件构成上有何差别？表达载体：启动子；终止子；核糖体结合位点（SD序列）；筛选标记；复制子（质粒
8、拷贝数）；多克隆位点克隆载体：筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点4、原核表达载体与真核表达载体及穿梭载体的区别1)真核表达载体和原核表达载体就是能在真核生物或原核生物中表达的载体,它们一般都带有能在真核生物或原核生物中表达的必需表达元件;2)真核表达和原核表达的目的都是为了能够大量获得自己所需要的目的基因的表达产物,最好有生物活性,以便下一步的实验需要.3)原核表达载体一般只能在原核生物中表达外源基因,但有些穿梭载体可以分别在真核和原核生物中表达它们的表达元件.5、什么是包涵体？重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高
9、效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。探针标记的方法：（1）缺口平移法 （Nick Translation）原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口处按5 3方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口处3端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。（2）随机引物法（6核苷酸引物标记法）原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的K
10、lenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5 3聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3端为起点，沿模板3 5方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。（3）末端标记多核苷酸激酶的用途:DNA5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。包括正向反应和交换反应标记法6、PCR反应的基本原理：1）变性：在PCR反应体系中，通过加热使温度至95左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。2）退火：PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板
11、互补区域结合，形成杂交链的过程。 3）延伸：当反应体系温度升至70左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的53延伸反应，形成新生DNA链。7、引物设计的基本原则最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。（1）引物长度一般为1530个核苷酸。 （2）碱基随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。G+C的含量为4555%。（3端和5端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54C。）（3）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠，连续互补序列一般不超过3bp。（4）引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。（5）引物3端
12、碱基一定要与模板DNA配对，最佳碱基选G和C而不用A。（6）引物的5端没有严格限制，可以修饰，如加限制酶位点，引入突变位点，起始密码子，终止密码子等。8简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）（1）直接从染色体DNA中分离：（1分）仅适用于原核生物、叶绿体和线粒体基因的分离，较少采用。 （2）人工合成：（1分）根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 （3）从mRNA合成cDNA：（1分）采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到
13、双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。 （4）利用PCR合成：（1分）如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，在体外合成目的基因。 （5）从基因文库中筛选：（1分）首先建立基因组或cDNA文库，利用探针从文库中筛选目的克隆。9. 分子克隆载体应具备哪些特点？（4分）(1) 在宿主细胞内必须能够自主复制（1分）(2) 必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制（1分）(3) 有一定的选择标记，用于筛选（1分）(4) 具有较高的拷贝数，便于载体的制备（1分）10. 受体细胞选择的基本原则 便于重
14、组DNA分子的导入便于DNA分子的稳定存在便于重组体筛选遗传稳定性高,易于扩大培养安全性高,无致病性内源水解酶缺失或蛋白酶低受体细胞遗传密码无偏性较好的转译和加工机制较大研究与应用价值11、 cDNA文库和基因组文库的主要差别有哪些？（5分）（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。（2分）（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响。（1分）（3）基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子，而cDNA文库克隆的是不含内含子的功能
15、基因。（2分）12、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？答：同：原理相同。琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性的稳定支持介质，可降低对流运动，故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。在一定电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小；浓度越高，空隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 异：琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为02.Kb-50Kb之间；而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范围为1-1000bp，分离小片段效果最好，分辨率极高，相差1bp的DNA也可分开。13、转基因与克隆的不同
16、将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术.科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。 克隆是对单体的复制，这和转基因有着很大的不同。转基因技术可以保持生物基因的多样性，而克隆却没有什么帮助，反而有一定的威胁。三、论述题 1、cDNA文库的构建（1）分离细胞总RNA , 纯化分离mRNA。 （2）以mRNA 为模板，在逆转录酶的催化下，合成cDNA 第一链，（3）双链cDNA 的合成：（dG
17、方法）cDNA第一链与mRNA模板分离之前，在第一链cDNA分子3端加上一段oligo（dC）。通过碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA模板分子降解，回收全长的cDNA第一链。最后以互补的oligo（dG）序列作为引物引导第二链cDNA的合成（4）将合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆菌)增殖2、什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段 的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)
18、体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。3、目的基因筛选的策略1、核酸杂交筛选原理：将基因文库的菌落或噬菌斑原位转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜之后，进行裂解，释放DNA并且固定在膜上，利用特异的核酸探针进行筛选，根据碱基配对原则筛选到目的基因。适用范围：（1）目的基因序列已知，利用该基
19、因作为探针筛选。（2）“基因园”：目的基因序列未知，同源基因已知，利用同源基因序列制备探针筛选。（3）寡核苷酸简并引物探针：对目的基因的表达产物的氨基酸序列有所了解，则可以从这些氨基酸序列倒过来推导出核酸的可能序列，合成寡核苷酸作为探针。2、抗体筛选（1）适用范围：已有目的基因表达产物的特异性抗体，利用抗体筛选表达特异抗原的克隆。（2）原理：将cDNA定向克隆到表达载体构建成表达文库，用能与目的基因表达产物特异结合的抗体与文库中能表达目的基因的克隆结合，再用标记的二抗与一抗结合，指示目的基因所在克隆。 3、功能结合法筛选适用范围：已知目的基因表达产物的功能（1）噬菌体显示法噬菌体展示技术的原理
20、 ：噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。（2）酵母单、双杂交法酵母质粒有PGBT9和PGAD424。酵母双杂合系统用于检测已知蛋白质之间的相互作用，还可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。4、Southern杂交一般过程及影响杂交因素。Southern杂交操作步骤:(1) 用限制性内切酶酶切DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段； (2) 转膜：将DNA片段
21、转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；(3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点； (4) 杂交：让探针与同源DNA片段特异性结合；(5) 洗脱：去除非特异性结合的探针；(6) 自显影检查目的DNA所在的位置。Southern杂交影响因子1）、目的DNA在总DNA中所占的比例2）、探针的大小和标记效率3）、转移到滤膜上的DNA量4）、探针与靶DNA的同源性5、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3端设计象5-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5端的随机引物（20
22、条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。优点：简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。所需的mRNA量少。各样本mRNA的差异可同时进行比较。扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发挥了极大的作用。（P221）6、抑制性差减杂交的原理与应用。原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其
23、中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。应用：l 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；l 基因时空表达的研究：如根、茎、叶；l 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。3、克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些类型？表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白7、Ti质粒介导转化的过程 根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着根癌农杆菌对植物信号物质的感受根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化
24、 vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中8、什么叫转基因植物？植物转基因技术的基本路线主要包括哪些？利用DNA重组技术，在离体条件下对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达的植物。植物转基因技术的基本路线分离目的基因目的基因与恰当的载体DNA形成重组DNA重组DNA的扩增目的基因导入到受体细胞筛选转化细胞，诱导产生转基因植株转基因植株的大规模种植2、外源基因导入植物的方法主要有哪些？Y 物理方法：电击法、基因枪法(biolistic)、显微注射法、微激光束法Y 化学方法：PEG介导法、脂质体介导法Y 生物学方法：农杆菌介导法、花粉管通道法9、基因工程的应用：医药业：疾病的预防;病的诊断;病的治疗农业及食品工业: 提高作物抗性;良作物品质;长果实货架期;用农作物生产药物畜牧业;工食品环境: 环境检测;环境净化专心-专注-专业