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1、第五章分子荧光分析法现在学习的是第1页，共49页 发光分析法发光分析法发光分析法发光分析法：物质吸收一定能量后跃迁到激发态，激发物质吸收一定能量后跃迁到激发态，激发态以辐射的形式释放能量返回低能态或基态的现象所建立的态以辐射的形式释放能量返回低能态或基态的现象所建立的分析方法。分析方法。光致发光：光致发光：以光能激发而产生的发光以光能激发而产生的发光 荧光和磷光荧光和磷光 光照、加热、化学反应、生物代谢等光照、加热、化学反应、生物代谢等现在学习的是第2页，共49页 荧光分析法荧光分析法荧光分析法荧光分析法：利用物质的荧光谱线位置及其强度，利用物质的荧光谱线位置及其强度，对物质进行定性和定量分析
2、的方法。对物质进行定性和定量分析的方法。定性鉴别：定性鉴别：由于不同的物质其组成与结构不同，由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同。所吸收光的波长和发射光的波长也不同。定量分析：如果该物质的浓度不同，它所发射定量分析：如果该物质的浓度不同，它所发射的荧光强度就不同。的荧光强度就不同。现在学习的是第3页，共49页 1.1.根据发光物质分类：分子荧光与原子荧光根据发光物质分类：分子荧光与原子荧光 2.2.根据激发光的波长范围分类：根据激发光的波长范围分类：紫外紫外-可见荧光、红外荧光、可见荧光、红外荧光、X X射线荧光射线荧光 荧光荧光荧光荧光分析法分类分析法分类分析法
3、分类分析法分类 荧光分析法特点荧光分析法特点：灵敏度高、选择型好、样品用量少、操作简便灵敏度高、选择型好、样品用量少、操作简便现在学习的是第4页，共49页第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生1.电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；大多数有机分子的基态处于单重态；现在学习的是第5页，共49页2.激发态基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃跃迁迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光磷
4、光内转移 外转移系间跨越振动弛豫无辐射跃迁现在学习的是第6页，共49页S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3外转换l l 2T2内转换振动弛豫现在学习的是第7页，共49页非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。现在学习的是第8页，共49页非辐射能量传递过程外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子
5、之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行现在学习的是第9页，共49页辐射能量传递过程发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；2 2 1荧光荧光：10-710-9s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；现在学习的是第10页，共49页二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线（图中曲线I）。选最强荧光强度的激发光波长
6、ex为测定波长，以提高灵敏度。1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线现在学习的是第11页，共49页2.荧光光谱(或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与激发光波长关系曲线(图中曲线II或III)。现在学习的是第12页，共49页现在学习的是第13页，共49页2.2.2.2.三维荧光光谱三维荧光光谱三维荧光光谱三维荧光光谱I I F F f f f f(exex 、emem)蒽的激发光谱蒽的激发光谱蒽的激发光谱蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长现在学习的是第14页，
7、共49页I I F F f f f f(exex 、emem)蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长现在学习的是第15页，共49页VBVB1 1和和和和VBVB2 2的三维荧光光谱的三维荧光光谱的三维荧光光谱的三维荧光光谱现在学习的是第16页，共49页3.荧光光谱的特征 a.Stokes位移位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关c.与与激发光谱呈镜像关系激发光谱呈镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜
8、像对称关系。现在学习的是第17页，共49页镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。现在学习的是第18页，共49页200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱现在学习的是第19页，共49页三、荧光的产生与分子结构的关系 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。（1）具有强的紫外-可见吸收的特
9、征结构(共轭大 键)（2）具有一定的荧光量子产率（）（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大 键)（2）具有一定的荧光量子产率（）现在学习的是第20页，共49页2.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭现在学习的是第21页，共49页现在学习的是第22页，共49页2.化合物的结构与荧光（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞
10、却没有。现在学习的是第23页，共49页四、荧光强度与荧光物质浓度的关系 稀溶液现在学习的是第24页，共49页五、影响荧光强度的因素2.溶剂的影响溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。3.溶液溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。1.温度的影响温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。现在学习的是第25页，共49页pH值值 pH13弱酸、弱碱弱酸、弱碱蓝色荧光蓝色荧光 现在学习的是第26页，共49页4.散射光：瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除拉曼散射光：
11、选择适当激发波长的方法消除 一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同方向散射。现在学习的是第27页，共49页硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱与拉曼光谱(b)荧光光谱荧光光谱拉曼光谱拉曼光谱瑞利光瑞利光320nm拉曼光拉曼光360nm拉曼光拉曼光400nm荧光荧光448nm激发激发320nm激发激发350nm瑞利光瑞利光350nm现在学习的是第28页，共49页5.荧光熄灭荧光熄灭荧光熄灭（荧光猝灭）：荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分子或由于荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起其它溶质分子碰撞而引起荧
12、光强度降低荧光强度降低或荧光强度与浓度或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。不呈线性关系的现象。荧光熄灭剂荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。：引起荧光熄灭的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、羰如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。现在学习的是第29页，共49页荧光自熄灭：荧光自熄灭：荧光物质浓度超过荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分子间碰时，增加荧光分子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。撞几率而产生的荧光熄灭现象。荧光熄灭法：荧光熄灭法：利用利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄灭剂的浓荧光物质荧光强度的
13、减弱与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。测定荧光熄灭剂含量的方法。(浓度限量浓度限量1g1mg/ml)现在学习的是第30页，共49页930型荧光计光路示意图型荧光计光路示意图激发滤光片激发滤光片发射滤光片发射滤光片第二节第二节 荧光分析仪器荧光分析仪器现在学习的是第31页，共49页一一一一.主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源光源光源光源氙氙氙氙灯灯灯灯激发单色器激发
14、单色器激发单色器激发单色器样品池样品池样品池样品池光电倍增管光电倍增管光电倍增管光电倍增管数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器发射单色器发射单色器发射单色器发射单色器问问问问题题题题：荧荧荧荧光光光光分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计与与与与紫紫紫紫外外外外-可可可可见见见见分分分分光光光光光光光光度度度度计计计计有何异同点？有何异同点？有何异同点？有何异
15、同点？现在学习的是第32页，共49页荧光分析仪器的主要部件荧光分析仪器的主要部件激发光源：激发光源：汞灯、卤钨灯、氙灯、汞灯、卤钨灯、氙灯、分光系统：分光系统：滤光片（两个）、单色器（光栅）滤光片（两个）、单色器（光栅）样器池：样器池：低荧光材料或石英材料，四面透光低荧光材料或石英材料，四面透光检测器：检测器：紫外紫外-可见（光电倍增管）可见（光电倍增管）显示系统显示系统：指针式、数字式及计算机显示：指针式、数字式及计算机显示现在学习的是第33页，共49页二、荧光分析仪器的类型二、荧光分析仪器的类型1.1.荧光光度计荧光光度计2.2.荧光分光光度计荧光分光光度计现在学习的是第34页，共49页荧
16、光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计结构示意图荧光分光光度计结构示意图分光系统：分光系统：分光系统：分光系统：光栅光栅用途：用途：用途：用途：测定测定激发光谱激发光谱、荧荧光光谱光光谱及及定量分析定量分析。最大激发波长最大激发波长 exexmaxmax和最大和最大荧光波长荧光波长 ememmaxmax是鉴定物质的是鉴定物质的依据和定量测定时最灵敏的依据和定量测定时最灵敏的条件。条件。激发单色器激发单色器发射单色器发射单色器现在学习的是第35页，共49页荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别荧光分光光度计与紫外分光光度计的区别 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计
17、光路光路光源光源仪器仪器校正校正吸收池吸收池入射光与吸收光同方入射光与吸收光同方向向入射光与荧光垂直入射光与荧光垂直方向方向两种光源两种光源(紫外紫外+可见可见)一种光源一种光源(紫外紫外)空白溶液空白溶液(F=0)荧光对照品溶液荧光对照品溶液(F=100%或或50%)空白溶液空白溶液(T=100%)紫外无吸收紫外无吸收两面透光两面透光低荧光材料低荧光材料四面透光四面透光现在学习的是第36页，共49页紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理
18、仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制荧光荧光荧光荧光(磷光磷光磷光磷光)分光光度计分光光度计分光光度计分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器现在学习的是第37页，共49页紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品池样品池样品池I0ItI0ItIF,p现在学习的是第38页，共49页第三节第三节 定性和定量分析定性和定量分析定量依据：定量依据：F=Kc定性依据荧光
19、光谱和激发光谱定性依据荧光光谱和激发光谱一、定性分析一、定性分析二、定量分析二、定量分析现在学习的是第39页，共49页1.1.标准曲线法标准曲线法标准曲线法标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法直接荧光标准曲线法F FC Cs sF Fx xC Cx x现在学习的是第40页，共49页2.直接比较法直接比较法现在学习的是第41页，共49页第四节第四节 荧光分析新技术荧光分析新技术激光荧光分析激光荧光分析时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析一、荧光新技术一、荧光新技术三维荧光分析三维荧光分析核酸分子荧光探针核酸分子荧光探针薄层扫描法中的荧光扫描法薄层扫描法中的荧光扫描法现在学
20、习的是第42页，共49页荧光分析的应用荧光分析的应用1.有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析研究对象：研究对象：芳香芳香族及具有芳香结构的化合物族及具有芳香结构的化合物 有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环结构的氨有机化合物：多环胺类、萘酚类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质基酸类及蛋白质药物：生物碱类；甾体类；抗生素类药物：生物碱类；甾体类；抗生素类(青霉素、四环；维生素青霉素、四环；维生素类类(维生素维生素A、B1、B2、B6、B12等等)中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）中草药：有效成分（芳香性结构的大分子杂环类）现在学习的是第43页，共49页荧光试剂荧光试
21、剂荧光胺荧光胺荧光条件：荧光条件：荧光条件：荧光条件：ex=275、390nm，em=480nm适用：适用：适用：适用：脂肪族和芳香族伯胺脂肪族和芳香族伯胺现在学习的是第44页，共49页邻邻苯二甲苯二甲醛醛(OPA)适用：适用：适用：适用：伯胺类、伯胺类、-氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸）氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸）荧光条件：荧光条件：荧光条件：荧光条件：ex=340nm，em=455nm (2-巯基乙醇存在，巯基乙醇存在，pH910的缓冲溶液的缓冲溶液)现在学习的是第45页，共49页2.无机化合物的荧光分析无机化合物的荧光分析测定方法：测定方法：与具有与具有电子共轭结构的有机
22、化合物形成荧光配电子共轭结构的有机化合物形成荧光配合物合物研究对象研究对象研究对象研究对象阳离子：阳离子：Al、Au、B、Be、Ca、Cd、Cu、Eu、Ga、Gd、Ge、Hf、Mg、Nb、Rh、Ru、S、Sb、Se、Si、Sn、Ta、Tb、Th、Te、W、Zn、Zr阴离子：阴离子：CN-、F-与与Al、Zr离子强烈配合离子强烈配合原有荧光配合原有荧光配合物的荧光减弱甚至熄灭物的荧光减弱甚至熄灭现在学习的是第46页，共49页 课后练习课后练习 名词解释：荧光与磷光、振动弛豫名词解释：荧光与磷光、振动弛豫溶液荧光光谱有哪些特征？溶液荧光光谱有哪些特征？能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？能够发射荧光的物质分子应同时具备哪些条件？为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？为什么荧光分析法适用于稀溶液的测定？现在学习的是第47页，共49页填空题填空题1荧光是物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的返回基态时发射出的光2荧光和磷光的区别在于荧光是从单线激发态开始的，磷光是由。3荧光发射光谱也称荧光光谱，其发射波长总是激发波长。现在学习的是第48页，共49页4能够发射荧光的物质应具备的条件是、。5影响荧光强度的外部因素有。现在学习的是第49页，共49页