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1、本章学习目标：本章学习目标：1、掌握分子荧光分析法的基本原理和特点掌握分子荧光分析法的基本原理和特点 2、掌握荧光与分子结构的关系以及影响荧光强度掌握荧光与分子结构的关系以及影响荧光强度的因素的因素 3、熟悉荧光定量分析方法及荧光分光光度计熟悉荧光定量分析方法及荧光分光光度计 4、了解分子荧光分析法的应用 第第0505章章 荧光分析法荧光分析法1 处处于于基基态态的的分分子子吸吸收收能能量量后后，跃跃迁迁到到激激发发态态，当当激激发发态态分分子子以以发发射射光光的的形形式式释释放放能能量量，返返回回基基态态的的过过程程，称为，称为分子发光分子发光。一、什么是分子发光？一、什么是分子发光？分子荧
2、光分析法分子荧光分析法2 二、分子发光的分类二、分子发光的分类(按激发的模式按激发的模式)分分子子发发光光热致发光热致发光光致发光光致发光场致发光场致发光化学发光化学发光荧光荧光磷光磷光 分子荧光分析法分子荧光分析法3 分子荧光分析法分子荧光分析法优点：优点：灵敏度高；选择性好；试样用量少；方法简单。光致发光光致发光：物质分子吸收电磁辐射能后，将从基态跃迁到激发态，处于激发态的分子发射出光的现象，称为光致发光。最常见形式是荧光和磷光荧光和磷光。荧光分析法：荧光分析法：根据物质的荧光光谱的特征及强度对物质进行定性和定量分析的方法，称之为荧光分析法。4第一节第一节 分子荧光分析法的基本原理分子荧光
3、分析法的基本原理（重点）（重点）一、分子荧光的产生一、分子荧光的产生单重态（单重态（S）：）：s=0，M=1，分子所处的电子能态。分子所处的电子能态。三重态（三重态（T）：）：s=1，M=3，分子所处的电子能态。分子所处的电子能态。1.1.分子的电子能级和激发过程分子的电子能级和激发过程分子电子能级的多重性：分子电子能级的多重性：总自旋量子数：总自旋量子数：E自旋量子数：自旋量子数：s=或或-泡利不相容原理泡利不相容原理52.荧光的产生荧光的产生 在单重激发态中，两个电子平行自旋平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为1010-8-8s s，而三重态分子具有顺磁三重态分子具有顺
4、磁性，其激发态的平均寿命为10-4 1s以上（通常用（通常用S S和和T T分别表示分别表示单重态单重态和和三重态三重态）。）。电子能级的电子能级的多重性：多重性：M=2s+1M=2s+1，s s（总自旋量子数）（总自旋量子数）6根据波兹曼分布，分子室温基本处于电子能级的基态电子能级的基态，激发时，基态电子只能跃迁到激发单重态激发单重态，不能不能直接跃迁到激发三重态（激发三重态（根据自旋禁阻定律）。电子处于激发态（不稳定状态），可通过无辐射跃迁无辐射跃迁和辐辐射跃迁射跃迁(发光)等方式失去能量，返回基态。2.荧光的产生荧光的产生能量传递能量传递途径途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光系间窜跃系
5、间窜跃无辐射跃迁无辐射跃迁振动弛豫振动弛豫内转换内转换外转换外转换7 在同一电子能级在同一电子能级中中，电子由电子由高高振动振动能级能级转至低转至低振动能振动能级级，而将多余的能，而将多余的能量量以无辐射形式以无辐射形式放放出的过程。出的过程。（1）振动弛豫）振动弛豫无辐射方式传递途径振动弛豫时间振动弛豫时间振动弛豫时间振动弛豫时间:1010-12-12 秒数量级秒数量级秒数量级秒数量级8 当当两个电子激发态之间的能级两个电子激发态之间的能级非常非常靠近靠近以至其振动能级有以至其振动能级有重叠重叠时，时，常发生电子由常发生电子由高高能级以能级以无辐射方式无辐射方式转移至转移至低低能级的过程能级
6、的过程。如右图，处于高激发态（如右图，处于高激发态（S2）的电）的电子，通过内转换，转移到低激发态子，通过内转换，转移到低激发态（S1）的振动能级。）的振动能级。（2）内转换）内转换9 激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而相互作用而失去能量失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换使荧光或磷光强度荧光或磷光强度减弱甚至消失减弱甚至消失。这一现象称为。这一现象称为“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。（3）外转换）外转换10 处于激发态分子的电子发生发生自自旋反转旋反转而使分子的多重性多重性发生变化的过程。如图，电子电子S S1 1的振动能级同的振动能级同T
7、 T1 1的振的振动能级重叠，则可能动能级重叠，则可能发生体系间跨越S1T1，分子由激发单重态跨越到激发三重态，荧光强度减弱甚至熄灭。（4）系间窜跃）系间窜跃11 物质分子吸收能量被激发后，从物质分子吸收能量被激发后，从激发激发单重态单重态的的最低振动能级最低振动能级返回基返回基态时发射出的态时发射出的光光，称为，称为荧光荧光。注意：注意：无论电子开始被激发至哪一个激发无论电子开始被激发至哪一个激发单重态，经过单重态，经过振动弛豫及内转换，振动弛豫及内转换，均可回均可回到到第一激发单重态的最低振动能级，第一激发单重态的最低振动能级，然后然后再以辐射形式发射光而返回至基态各振动再以辐射形式发射光
8、而返回至基态各振动能级上。能级上。荧光的产生在荧光的产生在1010-7-7-10-10-9-9s内完成。内完成。（1）发射荧光发射荧光辐射方式传递途径12 电子由第一激发单重态的最低电子由第一激发单重态的最低振动能级，以振动能级，以系间窜跃系间窜跃方式转至方式转至第一激发第一激发三重态三重态，再经三重态最，再经三重态最低振动能级返回至基态时发射的低振动能级返回至基态时发射的光，称为光，称为磷光磷光。由于（由于（T1S0）这个跃迁过程也）这个跃迁过程也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为约为10-4-10s。因此，这种跃迁因此，这种跃迁所发射的光，所发射的光，在光照停
9、止后，仍在光照停止后，仍可持续一段时间可持续一段时间。（2）发射磷光发射磷光13 荧光和磷光产生示意图荧光和磷光产生示意图S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃系间窜跃内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量 2 1 3 外转换 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫14二、激发光谱与荧光光谱激发光谱（激发光谱（excitation spectrum）：使使不同不同激发激发波长波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固荧光通过固定定发射发射波长波长的单色器而照到检测器上，测定不同激的单色器而照到检测器上，测定不同激发波长光照射下荧光强度
10、的变化，以发波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横激发波长为横坐标坐标，荧光强度为纵坐标荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光，可得荧光物质的激发光谱。谱。注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。15二、激发光谱与荧光光谱16 荧光光谱（荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发固定激发光波长光波长（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质（为最大激发波长）和强度，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同不同发发射射光波长下光波长下
11、的荧光强度，以的荧光强度，以发射波长为横坐标发射波长为横坐标，荧荧光强度为纵坐标作图光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。，得到物质的荧光光谱。荧光物质的荧光物质的最大激发波长（最大激发波长（ex）和）和最大发射最大发射波长（波长（em）是鉴定物质的根据；也是定量测定最是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。为灵敏的条件。17B.B.发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱(荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱)固定激发波长固定激发波长固定激发波长固定激发波长 扫描发射波长扫描发射波长扫描发射波长扫描发射波长C.C.激发光谱与发射激发光谱与发射激发光谱与发射激发光谱与发射光谱的镜像关系光谱的镜像关
12、系光谱的镜像关系光谱的镜像关系S S0 04 43 32 21 1S S1 14 43 32 21 1发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。exex
13、=290nm =290nm(MAX)(MAX)固定固定固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX)固定固定固定固定 exex=290nm(MAX)=290nm(MAX)emem=620nm 620nm(MAX)(MAX)1 1 4 41 1 3 31 1 2 21 11 11 1 1 11 1 2 21 1 3 3 1 1 4 4181.斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift):荧光发射波长总是大于激发光谱波长的现象。荧光发射波长总是大于激发光谱波长的现象。室温下菲的乙醇溶液荧光光谱荧光光谱的特征荧光光谱的特征（重点重点）192.2.荧光光谱与荧光光谱与激发波长无
14、关激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一电子第一电子激发单重态激发单重态的的最低最低振动能级再跃迁回到基态，从振动能级再跃迁回到基态，从而荧光发射光谱而荧光发射光谱只有一个发射带只有一个发射带，而且荧光光谱，而且荧光光谱的的形状形状与与激发波长无关激发波长无关。3.3.荧光光谱与荧光光谱与激发光谱的镜像关系激发光谱的镜像关系激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。20nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0
15、c0c1c2c3c4蒽的激发光谱（虚线）荧光光谱（实线）蒽的能级跃迁V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4E4E3E2E1E4E3E2E121（一）（一）分子产生荧光必须分子产生荧光必须具备两个条件具备两个条件：三、荧光强度与分子结构的关系分子必须具有与所照射的辐射频率相分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的适应的 结构结构，才能，才能吸收吸收激发光；激发光；吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的必须具有一定的荧光量子产率荧光量子产率。22荧光效率（荧光效率（fluorescenc
16、e efficiency):指激发态分子发射荧光的量子数与基态分子吸收激发光的量子数之比，常用表示。2324 （重点重点）252627282930三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素1、温度温度2、溶剂溶剂：极性、粘度：极性、粘度3、酸度酸度：荧光物质自身最适宜的：荧光物质自身最适宜的pH范围范围4、荧光熄灭剂荧光熄灭剂：主要四种类型：主要四种类型5、散射光散射光：瑞利光、拉曼光：瑞利光、拉曼光31五、影响荧光强度的外部因素温度降低，荧光效率和荧光强度升高。1）温度2）溶剂随着溶剂的随着溶剂的极性的增加极性的增加，荧光物质的，荧光物质的*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也
17、发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低；溶剂应达到足够的纯度。323）pH值值具酸或碱性基团的荧光物质，在不同具酸或碱性基团的荧光物质，在不同具酸或碱性基团的荧光物质，在不同具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pHpH值时，其值时，其值时，其值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。荧荧光物质都自身最适宜的光物质都自身最适宜的pH范围范围。NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+33荧光荧光淬淬灭（灭（荧光熄灭荧光熄灭）：荧光物质分子与溶剂分）：荧光物质分子与溶剂分子
18、或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光淬灭。的现象称为荧光淬灭。荧光荧光淬灭淬灭剂：能引起荧光熄灭的物质。剂：能引起荧光熄灭的物质。4)荧光淬灭荧光淬灭碰撞碰撞淬淬灭灭 M+hvM*,M*+Q M+热热静态静态淬淬灭灭 M+Q MQ 非荧非荧光物质光物质转入三重态的转入三重态的淬淬灭灭 三重态，氧的作用三重态，氧的作用荧光物质的自荧光物质的自淬淬灭灭 荧光物质浓度较高荧光物质浓度较高导致导致荧光淬灭荧光淬灭的的四种原因四种原因：34荧光淬淬灭法:荧光物质加入某种淬淬灭剂后，其荧光强度的减少与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定熄灭剂的
19、含量，这种方法称为荧光淬淬灭法。355)5)散射光散射光瑞利瑞利散射光散射光(Rayleigh scattering light)：光子与：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，运物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，运动方向改变；动方向改变；瑞利光瑞利光入射光入射光拉曼拉曼散射光散射光(Raman scattering light)：光子与光子与物质分子发生非弹性碰撞，发生能量交换，运物质分子发生非弹性碰撞，发生能量交换，运动方向改变；动方向改变；拉曼光拉曼光入射光入射光消除方法消除方法：选择：选择适当适当的激发波长的激发波长36320360448激发激发 320nm硫酸奎宁硫酸奎宁3
20、50448激发激发 350nm硫酸奎宁硫酸奎宁320360激发激发 320nm0.1mol/L硫酸硫酸350400激发激发 350nm0.1mol/L硫酸硫酸a.强度强度b.强度强度硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（a）与拉曼光谱（）与拉曼光谱（b）372 2、定量方法定量方法 1 1、定量依据定量依据 第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法38 优点优点 1.灵敏度高灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高24个数量级；个数量级；检测下限：检测下限：0.10.001 g/mL 2.选择性强选择性强 既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特
21、征；既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征；3.试样量少和方法简单试样量少和方法简单 缺点缺点应用范围小应用范围小391 1、定量依据定量依据 荧荧光光强强度度 If 正正比比于于吸吸收收的的光光强强度度 Ia 和和荧荧光量子产率光量子产率：由朗伯由朗伯-比耳定律得：比耳定律得：荧光强度荧光强度 If：40对于稀溶液，当对于稀溶液，当 2.303 bC 0.05时：时：If-荧光强度荧光强度I0-入射光强度入射光强度f-荧光量子产率荧光量子产率b-吸收光程吸收光程 -摩尔吸光系数摩尔吸光系数C-物质浓度物质浓度412 2、定量方法定量方法 标准曲线法：标准曲线法：FCsFxCx42直接比较
22、法直接比较法注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内步骤：步骤：1.1.配制标准溶液和试样溶液配制标准溶液和试样溶液2.2.测测I IF F3.3.求浓度求浓度43v对于荧光法对于荧光法 F=2.3k I0EClF I0，I0 增强，增强，F增大；低浓度时，增大；低浓度时，F C只要检测器灵敏，可检测微弱信号。只要检测器灵敏，可检测微弱信号。v对于分光光度法对于分光光度法 A=-lgT=EClC极小时，极小时，A0，无吸收；，无吸收；若若C不变，改变入射光不变，改变入射光I0强度，强度，A无变化。无变化。所以吸收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。所
23、以吸收光谱受一定限制，灵敏度小于荧光光谱。为什么荧光分析法比紫外可见法更灵敏？为什么荧光分析法比紫外可见法更灵敏？44 用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光荧光波长的单色器以及检测器四部分组成。由光源发射的光经第一单色器得到所需的激发光波长，通过样品池后，一部分光能被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发射荧光。第三节第三节 荧光分光光度计荧光分光光度计 45氙氙氙氙灯灯灯灯氙氙氙氙灯灯灯灯问题：问题：荧光分光光度荧光分光光度计与紫外计与紫外-可见分光光可见分光光度计有何异同点？度计有何异同点？46紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度计可见分光光度
24、计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计:光源光源光源光源样品池样品池样品池样品池激发激发激发激发单色器单色器单色器单色器检测器检测器检测器检测器数据处理数据处理数据处理数据处理仪器控制仪器控制仪器控制仪器控制发射发射发射发射单色器单色器单色器单色器474849紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计测量池测量池(吸收池吸收池)荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计样品池样品池样品池样品池I0ItI0ItIF
25、,p50在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的方在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的方向上进行测量，这是由于（向上进行测量，这是由于（）A.只有在入射光线成直角的方向上才有荧光只有在入射光线成直角的方向上才有荧光B.荧光强度比透射光强度小荧光强度比透射光强度小C.荧光强度比透射光强度大荧光强度比透射光强度大D.荧光波长比透射光波长长荧光波长比透射光波长长E.荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响荧光分光光度计常使用的光源是（荧光分光光度计常使用的光源是（）A.空心阴极灯空心阴极灯 B.氙灯氙灯 C.氢灯氢灯 D.硅碳棒硅碳棒BE51仪
26、器的校正（1）灵敏度的校正）灵敏度的校正 一定浓度的稳定荧光物质作对照品溶液调仪器一定浓度的稳定荧光物质作对照品溶液调仪器（如（如1ug/ml硫酸奎宁）硫酸奎宁）（2）波长校正）波长校正 汞灯的标准谱线汞灯的标准谱线（3）激发光谱和荧光光谱的校正）激发光谱和荧光光谱的校正 光源强度、检测器的感应度光源强度、检测器的感应度52荧光分析法的应用（1）无机化合物的分析）无机化合物的分析v采用有机试剂进行荧光分析的元素已近采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70多种多种v能够与金属离子形成荧光络合物的能够与金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数有机试剂绝大多数是芳香族化合物是芳香族化合物。（分子刚性平
27、面结构增大）。（分子刚性平面结构增大）v另一类络合物是三元离子缔合物。另一类络合物是三元离子缔合物。例：罗丹明例：罗丹明B为阳离子荧光染料，为阳离子荧光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等等阳离子首先与卤素离子形成二元络阴离子，再与罗丹阳离子首先与卤素离子形成二元络阴离子，再与罗丹明明B缔合形成荧光化合物。缔合形成荧光化合物。v荧光猝灭法荧光猝灭法也是常采用的方法。也是常采用的方法。53v脂肪族有机化合物本身能发荧光的很少，需要与某脂肪族有机化合物本身能发荧光的很少，需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析些试剂反应后才能进行荧光分析v芳香族化合物芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发因具有
28、共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可直接用荧光法测定。对具有致癌活性的生荧光，可直接用荧光法测定。对具有致癌活性的多环芳烃，荧光分析法已成为最主要的测定方法。多环芳烃，荧光分析法已成为最主要的测定方法。v在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析领域，许多重要的分析对象，如领域，许多重要的分析对象，如维生素、氨基酸和维生素、氨基酸和蛋白质、胺类、甾族化合物、酶和辅酶蛋白质、胺类、甾族化合物、酶和辅酶等，均可用等，均可用荧光法分析。荧光法分析。（2）有机化合物的分析）有机化合物的分析54荧光分析新技术简介1.激光荧光分析激光荧光分析激光作光源；超低浓
29、度分析激光作光源；超低浓度分析2.时间分辩荧光分析时间分辩荧光分析利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同来实现分别检测。测之间延缓的时间不同来实现分别检测。3.同步荧光分析同步荧光分析4.胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析55（1）关于荧光光谱和激发光谱，叙述错误的是（）关于荧光光谱和激发光谱，叙述错误的是（）A.荧光光谱的形状与激发光的波长无关荧光光谱的形状与激发光的波长无关B.荧光光谱和激发光谱一般是对称镜像关系荧光光谱和激发光谱一般是对称镜像关系C.荧光光谱是分子的吸收光谱荧光光谱是分子的吸收光谱D.荧光激发光谱和紫外吸收光谱的形状
30、相似荧光激发光谱和紫外吸收光谱的形状相似（2）溶液温度降低通常会使荧光效率）溶液温度降低通常会使荧光效率 。（3）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度）在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度 。（4）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（）下列化合物中，哪种物质的荧光效率最大（）A.苯苯 B.联苯联苯 C.萘萘 D.芴芴 E.蒽蒽（5）下列说法中正确的是（）下列说法中正确的是（）A.长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。长共轭结构使得分子的荧光波长向短波方向移动。B.分子的刚性越强，荧光强度越小。分子的刚性越强，荧光强度越小。C.给电子取代基可导致荧光增强。给电子取代基可导致荧光增强。D.吸电子取代基可导致荧光增强。吸电子取代基可导致荧光增强。561.激发态分子去激发的过程有哪些激发态分子去激发的过程有哪些?荧光发射和磷荧光发射和磷光发射经过哪些过程光发射经过哪些过程?为什么磷光发射比荧光发射慢为什么磷光发射比荧光发射慢?2.何为荧光产率？哪些分子结构的物质有较高的荧何为荧光产率？哪些分子结构的物质有较高的荧光效率？光效率？3.荧光分光光度计有哪些组成？荧光分光光度计有哪些组成？4.为什么有的分子能够发射荧光为什么有的分子能够发射荧光,有的不能有的不能?有机物有机物的荧光与其结构的关系是怎样的的荧光与其结构的关系是怎样的?57