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1、 LOGO萤火虫发光萤火虫发光LOGO第五章 分子发光分析法第一节 荧光分析法第二节 磷光分析法第三节 化学发光分析法LOGO第一节第一节 荧光分析法荧光分析法一、概述一、概述 1616世纪人们发现紫外和可见光照射到某些物质时，这些世纪人们发现紫外和可见光照射到某些物质时，这些物质会发光，当光照停止时，物质发光会停止。物质会发光，当光照停止时，物质发光会停止。18521852年斯托克斯（年斯托克斯（stokes)stokes)进行了解释。进行了解释。18671867年年GoppelsroderGoppelsroder应用铝应用铝-桑色素络合物的荧光对铝进桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。行了测
2、定。现在已是一种重要的方法现在已是一种重要的方法LOGO王伦教授王伦教授LOGO国家自然科学基金国家自然科学基金 生物大分子有机纳米荧光探针的制备及其应用（国家自生物大分子有机纳米荧光探针的制备及其应用（国家自然科学基金）然科学基金）(20375001)(20375001)基于纳米材料的荧光共振能量转移体系的研究及其在喹基于纳米材料的荧光共振能量转移体系的研究及其在喹诺酮类药物残留检测中的应用（国家自然科学基金）诺酮类药物残留检测中的应用（国家自然科学基金）(20575001)(20575001)LOGO朱昌青朱昌青 物种敏感量子点新型荧光探针的制备及应用物种敏感量子点新型荧光探针的制备及应用
3、 (20575002(20575002)Fluorescence enhancement method for the determination of nucleic acids using cationic cyanine as a fluorescence probe。Analyst，2004,129:254-258 2004,129:254-258 LOGO二、基本原理当一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发轨道上，也可能跃迁到能级更高的单重态上。处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态，辐射跃迁主要包括荧光、延迟荧光或磷光的发射。LOGOS2S1S0T1吸吸收收发
4、发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫LOGO电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发发光光)和无辐射跃迁等方式失去能量和无辐射跃迁等方式失去能量；2.2.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁延迟荧光延迟荧光 磷光磷光内转移内转移系间跨越系间跨越外转移外转移荧光：荧光：1010-7-710 10-9-9 s,s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷
5、光：磷光：1010-4-410s10s；第一激发三重态的最低振动能级；第一激发三重态的最低振动能级基态基态LOGO 振动施豫振动施豫(VR):(VR):同一电子能级中，电子由高振动能级转移至低振动能级而将同一电子能级中，电子由高振动能级转移至低振动能级而将多余的能量以热的形式发出，振动施豫时间为多余的能量以热的形式发出，振动施豫时间为1010-12-12s s。内转移：当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，内转移：当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生有高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。常发生有高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。外转移：激发分子与溶剂分子或溶质分子的相
6、互作用及能量转外转移：激发分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移而去活的过程称外转移。移而去活的过程称外转移。体系间跨越跃迁：指不同多重态间的无辐射跃迁。体系间跨越跃迁：指不同多重态间的无辐射跃迁。磷光发射：由第一激发态（单重）的最低振动能级有可能以系磷光发射：由第一激发态（单重）的最低振动能级有可能以系间窜跃的形式转至第一激发三重态，通过振动施豫转至其最低振间窜跃的形式转至第一激发三重态，通过振动施豫转至其最低振动能级，因此激发态跃回至基态时便发射磷光，动能级，因此激发态跃回至基态时便发射磷光，1010-4-4-100s-100s，这种，这种跃迁所发射的光在光照停止一段时间后仍可持续一
7、段时间跃迁所发射的光在光照停止一段时间后仍可持续一段时间 。非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程LOGO荧光发射荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为基态（多为 S S1 1 S S0 0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 2 2的荧光的荧光 1010-7-710 10-9-9 s s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；2 2 2 2 1 1 ；磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（基态（T T1 1 S S0 0跃迁跃
8、迁）；）；电子由电子由S S0 0进入进入T T1 1的可能过程：（的可能过程：（S S0 0 T T1 1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S S0 0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T T1 1 发光速度很慢：发光速度很慢：1010-4-4100s 100s。光照停止后，可持续一段时间光照停止后，可持续一段时间辐射能量传递过程LOGO(二二)荧光效率及其影响因素荧光效率及其影响因素1.1.荧光量子产率（荧光效率）荧光量子产率（荧光效率）荧光效率荧光效率K Kf f 为荧光发射过程的速率常数，为荧光发射过程的速率常数，K Ki i为非辐射跃迁的速率常数之和。为非辐射
9、跃迁的速率常数之和。一般来说：一般来说：K Kf f主要取决于物质的化学结构主要取决于物质的化学结构K Ki i主要取决于化学环境。荧光效率在主要取决于化学环境。荧光效率在0.1-1.00.1-1.0之间之间LOGO2、荧光与分子结构的关系（1 1）具有共轭双键体系的分子）具有共轭双键体系的分子=0.28 0.68=0.28 0.68（2 2）具有刚性平面结构的分子）具有刚性平面结构的分子很强 无 LOGO（3 3）取代基效应）取代基效应a.a.给电子基团常常使荧光增强。如给电子基团常常使荧光增强。如-OH,-OR,NHOH,-OR,NH2 2,-NHR,-NHR等。等。b.b.吸电子基团会减
10、弱甚至破坏荧光。吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。-COOH,COOH,C=0,-N0C=0,-N02 2 等等 滂铬BBR（无）AIAI3+3+_ _滂铬滂铬BBRBBR鏊合物鏊合物（有（红色）（有（红色）LOGOLOGO3 3 环境因素对荧光的影响环境因素对荧光的影响1.1.溶剂极性的影响：一般来说，电子激发态比基态具有更溶剂极性的影响：一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂增强，对激发态会产生更大的稳定大的极性，随着溶剂增强，对激发态会产生更大的稳定作用结果使物质的荧光波长红移荧光强度增大作用结果使物质的荧光波长红移荧光强度增大溶液溶液pHpH对于荧光强度的影响对于荧光强度的影响
11、LOGOpH 的影响LOGO（三）溶液的荧光强度溶液的荧光强度 荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 又根据朗伯比耳定律：又根据朗伯比耳定律：I IF F=2.3 =2.3 I I0 0 LCLC=KcKcI I0 0为激发光强度，为激发光强度，为摩尔吸光系数，为摩尔吸光系数，L L为样品池厚度，为样品池厚度，c c为样品为样品浓度浓度又对于很稀溶液，投射到样品上被吸收的激发光小到又对于很稀溶液，投射到样品上被吸收的激发光小到2%2%时。即时。即Lc0.05LLOGO（四（四 ）溶液的激发光谱和发射光谱）溶液的激发光谱和发射光谱荧光光谱荧光光谱 固定激发光波长固定激发光波长(选选最
12、大激发波长最大激发波长),),化合物化合物发射的荧光发射的荧光(或磷光强度或磷光强度)与发射光波长关系曲线与发射光波长关系曲线(图中曲线图中曲线IIII或或IIIIII)。LOGO激发光谱曲线激发光谱曲线 固定测量波长固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长),),化合物发射的荧光化合物发射的荧光(磷光磷光)强度与照射强度与照射光波长的关系曲线光波长的关系曲线 （图中曲线（图中曲线I I）LOGOLOGO三、荧光分析仪器一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源、样样品品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测
13、器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光(测测量量)波波长长的的第第二二单单色色器；器；光光源源：灯灯和和高高压压汞汞灯灯，染染料激光器料激光器(可见与紫外区可见与紫外区)检测器：光电倍增管。检测器：光电倍增管。LOGO仪器光路图LOGO四四 荧光分析的应用荧光分析的应用(一)无机化合物的分析有机试剂分析进行分析的元素近70种铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、
14、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定LOGO某些无机化合物荧光测定一览表某些无机化合物荧光测定一览表LOGO(二二)有机化合物的分析有机化合物的分析LOGO第二节第二节 磷光分析法磷光分析法 一一 概述概述 二二 基本原理基本原理(一一)磷光的产生和磷光强度磷光的产生和磷光强度I IP P=2.3=2.3 p pI I0 0 bC bC=KcKc式中：式中：p p 为为磷光效率磷光效率 I I0 0 为激发光的强度为激发光的强度。b b 试样池的光程试样池的光程LOGO(二）温度对磷光强度的影响低温有利于磷光的产生。低温有利于磷光的产生。（三）重原子效应（三）重原子效应 使用含有重原子的溶剂（如
15、碘乙烷）或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光强度。这种效应称为重原子效应。前者为外部重原子效应，后一种为内部重原子效应。（四）（四）室温磷光 在室温条件下，溶液中磷光太弱，不能用于分析，加入适当的表面活性剂后，由于形成了表面活性剂胶束，改变了磷光物质的微环境，增强了定向约束力，从而减少了磷光分子与溶剂分子的碰撞几率,增加了三种态的稳定性。LOGO磷光分析仪器磷光分析仪器1 1、试样室、试样室 低温磷光一般在液氮温度下进行，盛放试样的试样池低温磷光一般在液氮温度下进行，盛放试样的试样池需放置在盛液氮的杜瓦瓶内。需放置在盛液氮的杜瓦瓶内。2 2、磷光镜、磷光镜 通通常常借借助助于于荧荧光
16、光和和磷磷光光寿寿命命的的差差别别，采采用用磷磷光光镜镜的的装装置置将荧光隔开。将荧光隔开。LOGO第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法一、概述一、概述 生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是，直到十九世纪生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是，直到十九世纪末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。18771877年年 洛粉碱洛粉碱CLCL19051905年年 洛粉碱类似物洛粉碱类似物19281928年年 鲁米诺鲁米诺19351935年年 光泽精光泽精1960s 1960s 发现许多有机反应可产生发现许多有机反应可产生CLCL LOG
17、O化学发光反应的条件化学发光反应的条件 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。回基态时，发射出一定波长的光。A+B =C+DA+B =C+D*D D*D+D+h h（1 1）能快速地释放出足够的能量）能快速地释放出足够的能量（E E =170=170300 kJ/mol300 kJ/mol ）（2 2）反应途径有利于激发态产物的形成）反应途径有利于激发态产物的形成；（3 3）激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态）激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，或能够将其能量，或能够将其能量转移给可
18、以产生辐射跃迁的其它分子。转移给可以产生辐射跃迁的其它分子。化学发光反应存在于生物体化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物萤火虫、海洋发光生物)中，称生中，称生物发光物发光(bioluminescence)(bioluminescence)。二、基本原理二、基本原理LOGO三、化学发光反应的分类三、化学发光反应的分类直接化学发光直接化学发光A +B A +B C C*+D +DC C*C +h C +h 例例:NO+O NO+O3 3 NO NO2 2*+O+O2 2 NO NO2 2*NO NO2 2+h h LOGO 间接化学反应发光间接化学反应发光 A+B CA+B C*+D+D
19、 C C*+E E+E E*+C+C E E*E+h E+h LOGO化学发光效率化学发光效率化学效率化学效率：发光效率发光效率：dc/dc/dtdt 分析物参加反应的速率分析物参加反应的速率LOGO化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应对于一级动力学反应：dc/dt=Kc K K 为反应速率常数为反应速率常数。定量依据：定量依据：（1 1）在一定条件下，峰值光在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性强度与被测物浓度成线性；（2 2）在一定条件下，曲线
20、下面积为发光总强度在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)(S)，其与被其与被测物浓度成线性：测物浓度成线性：LOGO 三 化学发光的类型1 1、液相化学发光 鲁米诺鲁米诺(luminol)max=425 nm氧化剂:H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 Fe(CN)63-.催化剂:过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(Co2+、Cu2+、Fe3+etc.)（3-氨基苯二甲酰肼）氨基苯二甲酰肼）化学发光反应效率化学发光反应效率：LOGO 光泽精(lucigenin)max=440 nm(绿色绿色)氧化剂氧化剂:H2O2 还原剂还原剂+O2 还原剂还原剂:乳酸乳酸 尿酸尿酸 抗坏血酸抗坏
21、血酸催化剂催化剂:过渡金属离子过渡金属离子抑制剂抑制剂:酚类物质对此反应有抑制作用酚类物质对此反应有抑制作用LOGO过氧化草酸酯过氧化草酸酯 (peroxyoxalatesperoxyoxalates)氧化剂氧化剂:H2O2此反应本身能产生弱的化学发光此反应本身能产生弱的化学发光.max=440 nm,LOGO 邻菲罗林(1,10-phenanthroline)氧化剂氧化剂:H2O2 催化剂催化剂:Cu2+Co2+Pb2+Fe3+Ni2+抑制剂抑制剂:蛋白质与蛋白质与Cu2+形成络合物形成络合物LOGO2、气相化学发光a.一氧化氮与O3的发光反应 NO +O3 NO2*NO2*NO2+h 发射
22、的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 O2+O（1000 C石英管中进行石英管中进行）SO2 +O+O SO2*+O2 SO2*SO2*+h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；LOGO.乙烯与O3的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛：CH2O*CH2O+h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；LOGO四 、化学发光的仪器 装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静
23、态或流动注射的方式进行：静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；LOGO化学发光分析的特点化学发光分析的特点优点优点:灵敏度高灵敏度高,线性范围宽；线性范围宽；仪器简单仪器简单,价格便宜；价格便宜；分析时间短。分析时间短。缺点缺点:选择性差。选择性差。LOGO五、化学与生物发光分析的应用（1 1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的这一现象可间接测定这
24、些金属离子。可测痕量的CuCu2+2+、MnMn2+2+、CoCo2+2+、V V4+4+、FeFe2+2+、FeFe3+3+、NiNi2+2+、AgAg+、AuAu3+3+、HgHg2+2+等等（2）可检测低至可检测低至 1010-9-9 mol/L mol/L 的的H H2 2O O2 2；（3）间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸 +O O2 2 酮酸酮酸 +NH+NH3 3 +H+H2 2O O2 2 葡萄糖葡萄糖 +O +O2 2 +H+H2 2O O 葡萄糖酸葡萄糖酸 +H +H2 2O O2 2 通过测定生成的通过测定生成的H H2 2O O2 2 ，确定，确定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。LOGOThank you!Thank you!