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1、我公司相相关资料料龙葵总碱碱作用机机理之最最新研究究基质质金属蛋蛋白酶肿瘤，尤尤其是恶恶性肿瘤瘤，是引引起人类类死亡的的主要疾疾病之一一。在原原发灶的的远处组组织形成成转移灶灶的能力力（即转转移的能能力）是是高度恶恶性肿瘤瘤的一个个重要特特征，而而肿瘤的的转移性性也是癌癌症引起起死亡的的主要原原因。对对于绝大大多数原原发灶肿肿瘤细胞胞来说，其其中只有有一小部部分具有有转移能能力。这这些具有有高度转转移能力力的细胞胞具有以以下几种种特性：脱离原原发肿瘤瘤组织，向向淋巴管管或血管管中迁移移，穿过过血管基基底膜，穿穿透血管管腔，逃逃脱免疫疫监视，与与远离原原发灶器器官的血血管内皮皮细胞粘粘附，离离开
2、血管管（exxtraavattionn）,在在被侵入入的微环环境中存存活和生生长。现现在的观观点认为为基质金金属蛋白白酶（mmatrrix mettalllo pprotteinnasees,MMMP）在在肿瘤侵侵袭和转转移过程程中起重重要作用用。MMMP在肿肿瘤侵袭袭转移中中的作用用曾一度度被认为为只是破破坏基底底膜及EECM中中的其他他部分。现现已确认认MMPP在肿瘤瘤演进的的多个阶阶段均有有作用，它它影响肿肿瘤的起起始、生生长、血血管生成成、进入入血管/离开血血管和转转移。因因此，研研究抗肿肿瘤药物物对MMMPs的的影响，对对研究药药物的抗抗肿瘤转转移方面面具有重重要意义义1.关于于龙葵
3、中中生物碱碱对肿瘤瘤细胞MMMPss的影响响，尚未未见报道道。本次次实验，我我们建立立小鼠LLewiis肺癌癌移植瘤瘤模型，观观察龙葵葵总碱对对MMPP-9基基因mRRNA表表达的影影响，初初步探讨讨其抗肿肿瘤转移移的作用用机理。（一） 实验材料料：1、药材材与试剂剂：龙葵总碱碱,6mmg/瓶瓶，由吉吉林市卓卓怡康纳纳制药有有限公司司提供，批批号：22005506002；AA5499、LLLC肿瘤瘤株，由由南京中中医药大大学惠赠赠；注射射用环磷磷酰胺（CCTX），江江苏恒瑞瑞医药股股份有限限公司，批批号：00601119221；生生理盐水水，南京京小营制制药厂，批批号：220055052250
4、55；戊巴巴比妥钠钠，中国国医药（集集团）上上海化学学试剂公公司（进进口分装装），批批号：FF2000204405.2、实验验动物：C57BBL/66J小鼠鼠，6-8周龄龄，由南南京大学学模式动动物中心心提供，生生产许可可证：220055-00002.3、实验验仪器：GS-115R台台式冷冻冻离心机机（Beeckmman）;DK-8D电电热恒温温水浴槽槽（上海海精宏实实验设备备有限公公司）；CO22培养箱箱（Foormaa sccienntiffic）;Purrepllus纯纯水器（UU.S.A）;SW-CJ-1FDD净化工工作台（苏苏净集团团安泰公公司）；Leiica-DMIIL型倒倒置显微
5、微镜（LLeicca）;MP1120001电子子天平，上上海市恒恒平科学学仪器有有限公司司；ARR21440型电电子分析析天平，奥奥赛斯国国际贸易易（上海海）有限限公司。4、实验验条件：给药前后后，小鼠鼠分笼饲饲养，用用全价颗颗粒饲料料（由江江宁青龙龙山动物物繁殖场场提供）喂喂养；温温度200-255，湿度度40-60%。5、统计计方法：本实验量量反应资资料采用用方差分分析，统统计软件件用SPPSS113.00。ICC50计算算LOGGIT法法。（二） 实验方法法：取接种LLewiis肺癌癌14天天的C557BLL/6JJ荷瘤小小鼠，脱脱颈椎处处死，无无菌条件件下取瘤瘤组织，按按肿瘤质质量（g
6、g）与生生理盐水水（mll）1：3制备备匀浆液液，5000转/分钟离离心5分分钟，弃弃上清，用用生理盐盐水调整整细胞数数1106/mll备用，取取C577BL/6J小小鼠400只，分分别于右右腋皮下下接种匀匀浆液，每每只0.2mll（细胞胞数2105）。接接种后每每日观察察小鼠，等等小鼠肿肿瘤长出出，体积积约为11cm33时，按按肿瘤体体积将上上述小鼠鼠随机分分为5组组：生理理盐水（ssaliine）组组、龙葵葵总碱（SSNSAA）低、中中、高剂剂量组和和环磷酰酰胺（CCTX）组组。分组组后每组组给予相相应药物物。龙葵葵总碱低低、中、高高剂量组组剂量分分别为22、4、88mg/kg，腹腹腔注射
7、射，连续续给药55天。环环磷酰胺胺60mmg/kkg，每每隔7天天给药一一次。生生理盐水水组注射射同体积积生理盐盐水。第第14口口脱颈椎椎处死各各组小鼠鼠，取皮皮下瘤块块，迅速速放入液液氮中保保存，待待测MMMP-99基因mmRNAA表达2-44。用RT-PCRR法检测测Lewwis肺肺癌组织织MMPP-9基基因表达达。检测测方法如如下：（1）耗耗材处理理：0.1%DDEPCC水浸泡泡组织匀匀浆管、11.5mml离心心管、00.6mml离心心管、110000l、1100l、10l枪枪头等过过夜。弃弃DEPPC水，高高压蒸汽汽灭菌组组织匀浆浆管、11.5mml离心心管、00.6mml离心心管、1
8、10000l、1100l、10l枪枪头等。主要试剂剂：RNNAisso为TTAKAARA产产品，RRT-PPCR试试剂盒为为PROOMEGGA产品品，dNNTPss、MggCl22、rTTaq PCRR聚合酶酶、PCCR DDL20000 Marrkerr为TAAKARRA产品品，其余余试剂为为进口分分装。（2）大大鼠组织织提取总总RNAA及纯度度鉴定：取材：每组分分别随机机6各组织织（模11、2、4、5、7、8；阳1、3、4、6、7、8；高1、2、3、4、5、6；中1、2、3、4、6、8；小1、2、3、4、5、7），切切取约550-1100mmg组织织/管。每管加加入1mmlRNNAisso
9、试剂剂，匀浆浆器中进进行匀浆浆至无组组织碎片片，移入入1.55ml离离心管中中。室温温静置110miin。台台式高速速冷冻离离心机（美美国IEEC公司司，MPP4R）每管加加入0.2mll氯仿，小小心盖上上盖子，有有力振荡荡混合液液15ss，室温温放置55minn。4、1120000g离离心155minn小心将将水相转转移至一一干净的的离心管管内，加加入等体体积异丙丙醇，充充分混匀匀，室温温放置330miin。4、1120000g离离心100minn弃上清清，加入入75%乙醇11ml，44、1220000g离心心5miin。弃乙醇醇上清，干干燥，加加入无酶酶水，轻轻振荡使使溶解，离离心、混混匀
10、，转转入800保存。总RNNA纯度度鉴定：取出各各组总RRNA少少量，核核酸蛋白白定量仪仪（德国国EPPPENDDORFF公司，EEPPEENDOORF）检测各各组总RRNA浓浓度及纯纯度，各各组总RRNA纯纯度A2260/2800值在11.700-1.80。（三） 实验结果果龙葵总碱碱制剂各各组和模模型组相相比，MMMP-9基因因mRNNA表达达均降低低，其中中高剂量量和模型型组比较较，有显显著性差差异（PP0.01）。（四）小小结基质蛋白白溶解在在机体的的许多生生理和病病理过程程中都会会发生，如如生长、发发育、组组织修复复以及肿肿瘤生长长。基质质金属蛋蛋白酶（MMMPss）家族族，包括括胶
11、原酶酶、凝胶胶酶、基基质溶解解酶和模模型金属属蛋白酶酶类。在在细胞外外基质的的降解过过程中起起重要作作用。MMMP的的活性通通过蛋白白酶的激激活而被被严格调调控，在在此过程程中有特特殊的组组织抑制制因子的的参与。在在MMPPs中，两两种凝胶胶酶（MMMP-2凝胶酶酶A和MMMP-9凝胶酶酶B）来来自于独独特的亚亚家族，具具有改变变位于基基底膜上上胶原（凝凝胶）和和IV型型胶原的的底物特特异性。这这种IVV型胶原原溶解活活性和小小鼠黑色色素瘤以以及人结结肠癌潜潜在转移移性的增增加密切切相关。最最近研究究显示，不不仅肿瘤瘤细胞表表达MMMP-22和MMMP-99，肿瘤瘤细胞周周围的宿宿主细胞胞也同
12、时时表达MMMP-2和MMMP-9。提提示宿主主细胞分分泌的凝凝胶酶对对肿瘤生生长也起起一定作作用。在在本次实实验中，龙葵总碱具有较强的抑制肿瘤组织MMP-9基因mRNA表达作用，显示其具有一定的抗肿瘤转移作用，这也可能是治疗恶性肿瘤的作用机理之一。（五）参参考文献献1丁丁岩，陈陈晓光/基质金金属蛋白白酶与肿肿瘤的侵侵袭和转转移JJ.哈哈尔滨商商业大学学学报（自自然科学学版），220022，188（4）：3733-37782郭郭斌，韩韩冠英，李李智。红红鱼软骨骨多糖对对Lewwis肺肺癌MMMP-99表达的的影响J。中中国中药药杂志，220066，311（4）：3255-32283YYangg
13、 SFF,Chhu SSC,LLiu SJ, ettc.AAntiimettasttatiic aactiivittiess off Seelaggineellaa taamarrisccinaa (BBeauuv.)on lunng ccanccer cellls in vittro andd inn viivoJ.Jouurnaal oof EEthnnophharmmacoologgy,220077;1110(33):4493-9.4EEliaane Shiizukka NNakaamurra,KKeiiichii Kooizuumi,Mittsuoo Koobayyshii, eetc.Inhhibiitioon oof llympphanngioogennesiis-rrelaatedd prropeertiies of murrinee lyymphhatiic eendootheeliaal ccellls aand lymmph nodde mmetaastaasiss off luung canncerr byy thhe mmatrrix mettallloprroteeinaase inhhibiitorr MMMI2770JJ.CCanccer Scii,20004,95(1) 2531.