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1、实验二培养基的制备及灭菌第一页，讲稿共三十一页哦一一、实验目的、实验目的1 1、了解培养基制备原理，学习并掌握培、了解培养基制备原理，学习并掌握培养基制备方法。养基制备方法。2 2、掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理、掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和方法。和方法。第二页，讲稿共三十一页哦二、基本原理二、基本原理（一）培养基的制备原理（一）培养基的制备原理u培养基是微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。培养基是微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。u从营养角度分析：从营养角度分析：营养：碳源、氮源、生长因子、水分和无机盐等；营养：碳源、氮源、生长因子、水分和无机盐等；适宜的酸碱度适宜的酸碱度(pH值值)
2、和一定缓冲能力；和一定缓冲能力；一定的氧化还原电位；一定的氧化还原电位；合适的渗透压。合适的渗透压。第三页，讲稿共三十一页哦（二）灭菌原理（二）灭菌原理u1、干热灭菌原理、干热灭菌原理 干干热热是是指指相相对对湿湿度度在在20以以下下的的高高热热。干干热热消消毒毒灭灭菌菌是是由由空空气气导导热热，传传热热效效果果较较慢慢。一一般般繁繁殖殖体体在在干干热热80100中中经经1小小时时可可以以杀杀死死，芽芽孢孢需需160170经经2小小时时方方可杀死。可杀死。第四页，讲稿共三十一页哦第五页，讲稿共三十一页哦2、干热灭菌操作步骤、干热灭菌操作步骤u（1）在移液管尾部塞上少许棉花，然后用报纸条）在移液
3、管尾部塞上少许棉花，然后用报纸条 包好；用报纸条包好干燥的培养皿。包好；用报纸条包好干燥的培养皿。u（2）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注 意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通。意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通。u（3）开启电源，设定温度为）开启电源，设定温度为160 170，保持，保持 此温度此温度12小时。小时。u（4）切断电源，待温度降至）切断电源，待温度降至70以下时，打开箱以下时，打开箱 门，取出灭菌物品。门，取出灭菌物品。第六页，讲稿共三十一页哦第七页，讲稿共三十一页哦uu2 2、湿热灭菌原理高压蒸汽灭菌、湿热灭菌原理高压蒸汽灭菌 在在在在
4、密密密密闭闭闭闭的的的的蒸蒸蒸蒸锅锅锅锅内内内内，其其其其中中中中的的的的蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽不不不不能能能能外外外外溢溢溢溢，压压压压力力力力不不不不断断断断上上上上升升升升，使使使使水水水水的的的的沸沸沸沸点点点点不不不不断断断断提提提提高高高高，从从从从而而而而锅锅锅锅内内内内温温温温度度度度也也也也随随随随之之之之增增增增加加加加。在在在在0.1MPa0.1MPa的的压压力力下下，锅锅内内温温度度达达121121。在在此此蒸蒸汽汽温温度度下下，可可以以很很快快杀杀死死各各种种细细菌菌及及其其高高度度耐热的芽孢。耐热的芽孢。第八页，讲稿共三十一页哦高压蒸汽灭菌操作步骤高压蒸汽灭菌操作步骤（1
5、 1）加水：）加水：直直接接加加水水至至锅锅内内底底部部隔隔板板以以下下1/3处处。有有加加水水口口者者由由加加水水口口加加入入至至止止水水线线处。处。（2 2）装锅：）装锅：把需灭菌的器物放入锅内，关严锅盖。把需灭菌的器物放入锅内，关严锅盖。（3 3）接通热源：）接通热源：将将锅锅盖盖上上排排气气阀阀关关闭闭，同同时时打打开开底底部部排排气气阀阀。待待见见有有大大量量水水汽汽排排出出时时，维维持持35min，关上底部排气阀。，关上底部排气阀。第九页，讲稿共三十一页哦（4 4）升压、升温：）升压、升温：关关闭闭排排气气阀阀以以后后，锅锅内内成成为为密密闭闭系系统统，蒸蒸汽汽不不断断增增多多，压
6、压力力计计和和温温度度计计的的指指针针上上升升，当当压压力力达达到到 1.05 1.05 kg/cmkg/cm2 2（温温度度为为 121121）即即灭灭菌菌开开始，这时维持在始，这时维持在1.05 kg/cm1.05 kg/cm2 2，202030min30min。除含糖培养基用除含糖培养基用0.56 kg/cm0.56 kg/cm2 2压力外，一般都用压力外，一般都用 1.05 kg/cm1.05 kg/cm2 2压力。压力。（5 5）切断电源：）切断电源：达达到到灭灭菌菌时时间间要要求求后后停停止止加加热热，任任其其自自然然降降压压，当当指指针针回回到到0 0时时，打开排气阀。打开排气阀
7、。高压蒸汽灭菌操作步骤高压蒸汽灭菌操作步骤第十页，讲稿共三十一页哦（6 6）揭开锅盖，取出灭菌物，排掉锅内剩余水。）揭开锅盖，取出灭菌物，排掉锅内剩余水。（7 7）待培养基冷却后置于）待培养基冷却后置于3737恒温箱内培养恒温箱内培养24h24h，若无，若无 菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。高压蒸汽灭菌操作步骤高压蒸汽灭菌操作步骤第十一页，讲稿共三十一页哦注意事项注意事项！u（1 1）灭菌物不要装得太满，否则灭菌）灭菌物不要装得太满，否则灭菌 不彻底。不彻底。u（2 2）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使
8、漏气。漏气。u（3 3）排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，）排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温度没下降会使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失温度没下降会使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失 培养基又沾污了棉塞。培养基又沾污了棉塞。第十二页，讲稿共三十一页哦三、实验器材三、实验器材1、药药品品：琼琼脂脂，10HCL（各各组组自自配配），10%NaOH（各各组组自自配配），牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基、高高氏氏I号号培培养养基基和和马马铃铃薯薯葡葡萄萄糖糖（蔗糖）琼脂培养基（蔗糖）琼脂培养基（PDA）的配方药品。）的配方药品。2、材材料料：刻刻度度1000mL塘塘瓷瓷量量杯杯，天天平
9、平，试试管管，量量筒筒，小小烧烧杯杯，玻玻璃璃棒棒，药药匙匙，pH试试纸纸，棉棉花花，报报纸纸，麻麻绳绳，标标签签，培培养养皿等。皿等。3、设备：、设备：高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。第十三页，讲稿共三十一页哦四、实验方法及步骤四、实验方法及步骤（一）牛肉膏蛋白胨（一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备培养基的制备 u1、称量、称量u2、溶解、溶解u3、调、调pHu4、过滤、过滤u5、分装、分装u6、加塞、加塞u7、包扎、包扎u8、灭菌、灭菌u9、搁置斜面、搁置斜面u10、无菌检查、无菌检查步步 骤 牛肉膏牛肉膏 3g 蛋白胨蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂
10、琼脂 20g 水水 1000mL pH 7.47.6 配配 方方第十四页，讲稿共三十一页哦1、称、称 量量u按培养基配方比例依次准确地称取所需药品放入烧杯中。按培养基配方比例依次准确地称取所需药品放入烧杯中。u牛牛肉肉膏膏常常用用玻玻棒棒挑挑取取，放放在在小小烧烧杯杯或或表表面面皿皿中中称称量量，用用热热水水溶溶化化后后倒倒入入烧烧杯杯。也也可可放放在在称称量量纸纸上上，称称量量后后直直接接放放入入水水中中，这这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。u蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速
11、。u称称药药品品时时严严防防药药品品混混杂杂，一一把把牛牛角角匙匙用用于于一一种种药药品品，或或称称取取一一种种药药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。第十五页，讲稿共三十一页哦3、调、调pHu在在未未调调pH前前，先先用用精精密密pH试试纸纸测测量量培培养养基基的的原原始始pH值值，如如果果pH偏偏酸酸，用用滴滴管管向向培培养养基基中中逐逐滴滴加加入入1mol/L NaOH，边边加加边边搅搅拌拌，并并随随时时用用pH试试纸纸测测其其pH值值，直直至至pH达达7.6，反之，则用反之，则用1mol/LHCl进行调节。进行调节。u注注
12、意意pH值值不不要要调调过过头头，以以避避免免回回调调，否否则则，将将会会影影响响培培养养基内各离子的浓度。基内各离子的浓度。u对对于于有有些些要要求求pH值值较较精精确确的的微微生生物物，其其pH的的调调节节可可用用酸酸度计进行度计进行。第十六页，讲稿共三十一页哦4、过、过 滤滤u趁趁热热用用滤滤纸纸或或多多层层纱纱布布过过滤滤，以以利利结结果果的的观观察察。一一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。第十七页，讲稿共三十一页哦2、溶、溶 解解u在在上上述述烧烧杯杯中中可可先先加加入入少少于于所所需需要要的的水水量量，用用玻玻棒棒搅搅匀匀，然然后后，在在石
13、石棉棉网网上上加加热热使使其其溶溶解解。待待药药品品完完全溶解后，补充水分到所需的总体积。全溶解后，补充水分到所需的总体积。u如如果果配配制制固固体体培培养养基基，将将称称好好的的琼琼脂脂放放入入已已溶溶化化的的药药品品中中，再再加加热热溶溶化化，在在琼琼脂脂溶溶化化的的过过程程中中，需需不不断断搅搅拌拌，以以防防琼琼脂脂糊糊底底使使烧烧杯杯破破裂裂。最最后后补补足足所所失失的水分。的水分。第十八页，讲稿共三十一页哦5、分、分 装装u按按实实验验要要求求，可可将将配配制制的的培培养养基基分分装装入入试试管管内内或或三三角角烧烧瓶瓶内内。分分装装过过程程中中注注意意不不要要使使培培养养基基沾沾在
14、在管管口口或或瓶瓶口口上上，以以免免沾沾污污棉塞而引起污染。棉塞而引起污染。u(1)液体分装分装高度以试管高度的液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。左右为宜。u(2)固固体体分分装装分分装装试试管管，其其装装量量不不超超过过管管高高的的1/5，灭灭菌菌后后制制成成斜斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。u(3)半固体分装试管一般以试管高度的半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。为宜，灭菌后垂直待凝。第十九页，讲稿共三十一页哦第二十页，讲稿共三十一页哦6、加、加 塞塞u培培养养基基分分装装完完毕毕后后
15、，在在试试管管口口或或三三角角烧烧瓶瓶口口上上塞塞上上棉棉塞塞，以以阻阻止止外外界界微微生生物物进进入入培培养养基基内内而而造造成成污污染染，并并保证有良好的通气性能。保证有良好的通气性能。第二十一页，讲稿共三十一页哦7、包、包 扎扎u加加塞塞后后，将将全全部部试试管管用用麻麻绳绳捆捆扎扎好好，再再在在棉棉塞塞外外包包一一层层牛牛皮皮纸纸，以以防防止止灭灭菌菌时时冷冷凝凝水水润润湿湿棉棉塞塞，其其外外再再用用一一道道麻麻绳绳扎扎好好。用用记记号号笔笔注注明明培培养养基基名名称称、组组别别、日日期。期。u三三角角烧烧瓶瓶加加塞塞后后，外外包包牛牛皮皮纸纸，用用麻麻绳绳以以活活结结形形式式扎扎好好
16、，使使用用时时容容易易解解开开，同同样样用用记记号号笔笔注注明明培培养养基基名称、组别、日期。名称、组别、日期。第二十二页，讲稿共三十一页哦8、灭、灭 菌菌u将上述培养基以将上述培养基以121，20分钟高压蒸汽灭菌。分钟高压蒸汽灭菌。u如如因因特特殊殊情情况况不不能能及及时时灭灭菌菌，则则应应放放入入冰冰箱箱内内暂暂存。存。第二十三页，讲稿共三十一页哦9、搁置斜面、搁置斜面uu将将灭灭菌菌的的试试管管培培养养基基冷冷至至5050左左左左右右右右，将将将将试试试试管管管管棉棉棉棉塞塞塞塞端端端端搁搁搁搁在在在在玻玻玻玻棒棒棒棒上上上上，搁搁搁搁置置置置的的的的斜斜斜斜面面面面长长长长度度度度不不
17、不不要要要要超超超超过过过过试试试试管管管管总总总总长长长长的的的的一一一一半。半。半。半。第二十四页，讲稿共三十一页哦10、无菌检查、无菌检查uu为为为为检检检检查查查查灭灭灭灭菌菌菌菌是是是是否否否否彻彻彻彻底底底底，需需需需将将将将灭灭灭灭菌菌菌菌的的的的培培培培养养养养基基基基放放放放入入入入3737的温室中培养的温室中培养24-4824-48小时。小时。小时。小时。第二十五页，讲稿共三十一页哦（二二）马马铃铃薯薯(PDA)培培养养基基的的制制备备(真真菌菌用用)马铃薯马铃薯 200g 蒸馏水蒸馏水 1000mL蔗糖（葡萄糖）蔗糖（葡萄糖）20g pH 自然自然 琼脂琼脂 20g第二十
18、六页，讲稿共三十一页哦u马马铃铃薯薯汁汁制制备备：将将马马铃铃薯薯去去皮皮，称称量量所所需需重重量量，切切成成小块，小块，加水煮沸加水煮沸30min。u用滤纸或用滤纸或双层纱布双层纱布(中间夹一层脱脂棉花中间夹一层脱脂棉花)趁热趁热过滤。过滤。u滤滤液液煮煮沸沸后后加加糖糖，用用于于培培养养霉霉菌菌的的加加入入蔗蔗糖糖，用用于于培养培养酵母菌的加入葡萄糖酵母菌的加入葡萄糖，再加入其它。，再加入其它。u其余同牛肉膏蛋白胨培养基的制备。其余同牛肉膏蛋白胨培养基的制备。第二十七页，讲稿共三十一页哦（三）（三）高氏高氏I号培养基的制备号培养基的制备(放线菌菌用放线菌菌用)可溶性淀粉可溶性淀粉 20g
19、KNO3 1gNaCl 0.5g K2HPO43H2O 0.5gMgSO47H2O 0.5g FeSO47H2O 0.01g琼脂琼脂 20g 水水 1000mLpH 7.4-7.6 第二十八页，讲稿共三十一页哦u按按配配方方先先称称取取可可溶溶性性淀淀粉粉，放放入入小小烧烧杯杯中中，并并用用少少量量冷冷水水将将淀淀粉粉调调成成糊糊状状，再再加加入入少少于于所所需需水水量量的的沸沸水水，继继续续加加热热，使使可可溶溶性性淀淀粉粉完完全全熔熔化化，然然后后再再称称取取其其各各成成分分依依次熔化。次熔化。u对对微微量量成成分分FeSO47H2O，可可先先在在100mL水水中中加加入入1g的的FeSO
20、47H2O，配配成成0.01g/mL，再再在在10000mL培培养养基基中中加加1mL的的0.01g/mL的贮备液。的贮备液。u其它同牛肉膏蛋白胨培养基的配置。其它同牛肉膏蛋白胨培养基的配置。第二十九页，讲稿共三十一页哦注意事项注意事项！u（1）在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅拌，）在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅拌，避免琼脂糊底烧焦。避免琼脂糊底烧焦。u（2）液体培养基：分装高度以试管的）液体培养基：分装高度以试管的1/4左右为宜。左右为宜。u（3）固体培养基：分装试管，其装量为管高的）固体培养基：分装试管，其装量为管高的1/61/5 灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量以一半为宜。灭
21、菌后制成斜面。分装三角瓶容量以一半为宜。u（4）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的1/3为为 宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。u（5）不要使培养基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干）不要使培养基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干 净的纱布擦干净。净的纱布擦干净。第三十页，讲稿共三十一页哦三、培养基配制任务分配三、培养基配制任务分配 全班同学共分成全班同学共分成4组，每组组，每组7人人u一组完成一组完成马铃薯马铃薯(PDA)培养基培养基（霉菌用，（霉菌用，用用蔗糖），蔗糖），u二组完成二组完成马铃薯马铃薯(PDA)培养基培养基（酵母菌用，（酵母菌用，用用葡萄糖），葡萄糖），u三组完成三组完成高氏高氏I号培养基号培养基（用于放线菌培养），（用于放线菌培养），u四组完成四组完成牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基（用于细菌培养）。（用于细菌培养）。每每组组的的培培养养基基均均配配制制成成1000mL，分分装装4个个三三角角瓶瓶（150mL），其其余余分分装试管做成斜面。装试管做成斜面。第三十一页，讲稿共三十一页哦