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1、试验三试验三 培育基的制备及灭菌培育基的制备及灭菌一一、试验目的、试验目的1 1、了解培育基制备原理，学习并驾驭培、了解培育基制备原理，学习并驾驭培育基制备方法。育基制备方法。2 2、驾驭干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理、驾驭干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和方法。和方法。二、基本原理二、基本原理（一）培育基的制备原理（一）培育基的制备原理培育基是微生物生长、繁殖、代谢的混培育基是微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。合养料。从养分角度分析：从养分角度分析：养分：碳源、氮源、生长因子、水养分：碳源、氮源、生长因子、水分和无机盐等；分和无机盐等；适宜的酸碱度适宜的酸碱度(pH值值)和确定缓冲实和确定缓冲实力
2、；力；确定的氧化还原电位；确定的氧化还原电位；合适的渗透压。合适的渗透压。（二）灭菌原理（二）灭菌原理u1、干热灭菌原理、干热灭菌原理 干干热热是是指指相相对对湿湿度度在在20以以下下的的高高热热。干干热热消消毒毒灭灭菌菌是是由由空空气气导导热热，传传热热效效果果较较慢慢。一一般般繁繁殖殖体体在在干干热热80100中中经经1小小时时可可以以杀杀死死，芽芽孢孢需需160170经经2小小时时方可杀死。方可杀死。2、干热灭菌操作步骤、干热灭菌操作步骤u（1）在移液管尾部塞上少许棉花，然后用报纸条）在移液管尾部塞上少许棉花，然后用报纸条u 包好；用报纸条包好干燥的培育皿。包好；用报纸条包好干燥的培育皿
3、。u（2）将待灭菌物品包扎好，匀整放入烘箱内，注）将待灭菌物品包扎好，匀整放入烘箱内，注u 意不要摆的太挤，以免阻碍气流流通。意不要摆的太挤，以免阻碍气流流通。u（3）开启电源，设定温度为）开启电源，设定温度为160 170，保持，保持u 此温度此温度12小时。小时。u（4）切断电源，待温度降至）切断电源，待温度降至70以下时，打开箱以下时，打开箱u 门，取出灭菌物品。门，取出灭菌物品。uu2 2、湿热灭菌原理高压蒸汽灭菌、湿热灭菌原理高压蒸汽灭菌 在在在在密密密密闭闭闭闭的的的的蒸蒸蒸蒸锅锅锅锅内内内内，其其其其中中中中的的的的蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽不不不不能能能能外外外外溢溢溢溢，压压压压力力力
4、力不不不不断断断断上上上上升升升升，使使使使水水水水的的的的沸沸沸沸点点点点不不不不断断断断提提提提高高高高，从从从从而而而而锅锅锅锅内内内内温温温温度度度度也也也也随随随随之之之之增增增增加加加加。在在在在0.1MPa0.1MPa的的的的压压压压力力力力下下下下，锅锅锅锅内内内内温温温温度度度度达达达达121121。在在在在此此此此蒸蒸蒸蒸汽汽汽汽温温温温度度度度下下下下，可可可可以以以以很很很很快快快快杀杀杀杀死死死死各种细菌及其高度耐热的芽孢。各种细菌及其高度耐热的芽孢。各种细菌及其高度耐热的芽孢。各种细菌及其高度耐热的芽孢。高压蒸汽灭菌操作步骤高压蒸汽灭菌操作步骤（1 1）加水：）加水
5、：干干脆脆加加水水至至锅锅内内底底部部隔隔板板以以下下1/31/3处处。有加水口者由加水口加入至止水线处。有加水口者由加水口加入至止水线处。（2 2）装锅：）装锅：把把需需灭灭菌菌的的器器物物放放入入锅锅内内，关关严严锅锅盖。盖。（3 3）接通热源：）接通热源：将将锅锅盖盖上上排排气气阀阀关关闭闭，同同时时打打开开底底部部排排气气阀阀。待待见见有有大大量量水水汽汽排排出出时时，维维持持3 35min5min，关上底部排气阀。，关上底部排气阀。（4 4）升压、升温：）升压、升温：关关闭闭排排气气阀阀以以后后，锅锅内内成成为为密密闭闭系系统统，蒸蒸汽汽不不断断增增多多，压压力力计计和和温温度度计计
6、的的指指针针上上升升，当当压压力力达达到到 1.05 1.05 kg/cm2kg/cm2（温温度度为为 121121）即即灭灭菌菌起起先先，这这时时维维持持在在1.05 1.05 kg/cm2kg/cm2，202030min30min。除除含含糖糖培培育育基基用用0.56 0.56 kg/cm2kg/cm2压压力力外外，一一般都用般都用 1.05 kg/cm2 1.05 kg/cm2压力。压力。（5 5）切断电源：）切断电源：达达到到灭灭菌菌时时间间要要求求后后停停止止加加热热，任任其其自然降压，当指针回到自然降压，当指针回到0 0时，打开排气阀。时，打开排气阀。高压蒸汽灭菌操作步骤高压蒸汽灭
7、菌操作步骤（6 6）揭开锅盖，取出灭菌物，排掉锅内剩余水。）揭开锅盖，取出灭菌物，排掉锅内剩余水。（7 7）待培育基冷却后置于）待培育基冷却后置于3737恒温箱内培育恒温箱内培育24h24h，若无，若无 菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。高压蒸汽灭菌操作步骤高压蒸汽灭菌操作步骤留意事项！留意事项！u（1 1）灭菌物不要装得太满，否则灭菌）灭菌物不要装得太满，否则灭菌 不彻底。不彻底。u（2 2）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使u 漏气。漏气。u（3 3）排气阀不能过早打开，否则培育基因压力突降，）排气阀不能
8、过早打开，否则培育基因压力突降，u 温温度度没没下下降降会会使使培培育育基基翻翻腾腾冲冲到到棉棉塞塞处处，既既损损失失u 培育基又沾污了棉塞。培育基又沾污了棉塞。三、试验器材三、试验器材1、药药品品：琼琼脂脂，10HCL（各各组组自自配配），10%NaOH（各各组组自自配配），牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培育育基基、高高氏氏I号号培培育育基基和和马马铃铃薯薯葡葡萄萄糖糖（蔗蔗糖糖）琼琼脂脂培培育育基基（PDA）的的配配方方药品。药品。2、材材料料：刻刻度度1000mL塘塘瓷瓷量量杯杯，天天平平，试试管管，量量筒筒，小小烧烧杯杯，玻玻璃璃棒棒，药药匙匙，pH试试纸纸，棉棉花花，报报纸纸，麻麻绳绳，
9、标签，培育皿等。标签，培育皿等。3、设备：高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。、设备：高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等。四、试验方法及步骤四、试验方法及步骤（一）牛肉膏蛋白胨培育基的制备（一）牛肉膏蛋白胨培育基的制备 u1、称量、称量u2、溶解、溶解u3、调、调pHu4、过滤、过滤u5、分装、分装u6、加塞、加塞u7、包扎、包扎u8、灭菌、灭菌u9、搁置斜面、搁置斜面u10、无菌检查、无菌检查步步 骤 牛肉膏牛肉膏 3g 蛋白胨蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂琼脂 20g 水水 1000mL pH 7.47.6 配配 方方1、称、称 量量u按培育基配方比例依次精确地称取所需药品放入烧杯中
10、。按培育基配方比例依次精确地称取所需药品放入烧杯中。u牛牛肉肉膏膏常常用用玻玻棒棒挑挑取取，放放在在小小烧烧杯杯或或表表面面皿皿中中称称量量，用用热热水水溶溶化化后后倒倒入入烧烧杯杯。也也可可放放在在称称量量纸纸上上，称称量量后后干干脆脆放放入入水水中中，这这时时如如略略微微加加热热，牛牛肉肉膏膏便便会会与与称称量量纸纸分分别别，然后马上取出纸片。然后马上取出纸片。u蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要快速。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要快速。u称称药药品品时时严严防防药药品品混混杂杂，一一把把牛牛角角匙匙用用于于一一种种药药品品，或或称称取取一一种种药药品品后后，洗洗净净、擦擦干干，再再称称取取另
11、另一一药药品品，瓶瓶盖盖也也不要盖错。不要盖错。3、调、调pHu在在未未调调pH前前，先先用用精精密密pH试试纸纸测测量量培培育育基基的的原原始始pH值值，假假如如pH偏偏酸酸，用用滴滴管管向向培培育育基基中中逐逐滴滴加加入入1mol/L NaOH，边边加加边边搅搅拌拌，并并随随时时用用pH试试纸纸测测其其pH值值，直直至至pH达达7.6，反反之之，则则用用1mol/LHCl进进行行调调整。整。u留留意意pH值值不不要要调调过过头头，以以避避开开回回调调，否否则则，将将会会影影响培育基内各离子的浓度。响培育基内各离子的浓度。u对对于于有有些些要要求求pH值值较较精精确确的的微微生生物物，其其p
12、H的的调调整整可可用酸度计进行用酸度计进行。4、过、过 滤滤u趁趁热热用用滤滤纸纸或或多多层层纱纱布布过过滤滤，以以利利结结果果的的视视察察。一般无特殊要求的状况下，这一步可以省去。一般无特殊要求的状况下，这一步可以省去。2、溶、溶 解解u在在上上述述烧烧杯杯中中可可先先加加入入少少于于所所须须要要的的水水量量，用用玻玻棒棒搅搅匀匀，然然后后，在在石石棉棉网网上上加加热热使使其其溶溶解解。待待药药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。u假假如如配配制制固固体体培培育育基基，将将称称好好的的琼琼脂脂放放入入已已溶溶化化的的药药品品中中，再再加加热热溶溶化化，
13、在在琼琼脂脂溶溶化化的的过过程程中中，需需不不断断搅搅拌拌，以以防防琼琼脂脂糊糊底底使使烧烧杯杯裂裂开开。最最终终补补足所失的水分。足所失的水分。5、分、分 装装u按按试试验验要要求求，可可将将配配制制的的培培育育基基分分装装入入试试管管内内或或三三角角烧烧瓶瓶内内。分分装装过过程程中中留留意意不不要要使使培培育育基基沾沾在在管管口口或或瓶瓶口口上上，以免沾污棉塞而引起污染。以免沾污棉塞而引起污染。u(1)液体分装分装高度以试管高度的液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。左右为宜。u(2)固固体体分分装装分分装装试试管管，其其装装量量不不超超过过管管高高的的1/5，灭灭菌菌后后制制成成斜
14、斜面面。分分装装三三角角烧烧瓶瓶的的量量以以不不超超过过三三角角烧烧瓶瓶容容积积的的一半为宜。一半为宜。u(3)半半固固体体分分装装试试管管一一般般以以试试管管高高度度的的1/3为为宜宜，灭灭菌菌后后垂垂直待凝。直待凝。6、加、加 塞塞u培培育育基基分分装装完完毕毕后后，在在试试管管口口或或三三角角烧烧瓶瓶口口上上塞塞上上棉棉塞塞，以以阻阻挡挡外外界界微微生生物物进进入入培培育育基基内内而而造造成成污染，并保证有良好的通气性能。污染，并保证有良好的通气性能。7、包、包 扎扎u加加塞塞后后，将将全全部部试试管管用用麻麻绳绳捆捆扎扎好好，再再在在棉棉塞塞外外包包一一层层牛牛皮皮纸纸，以以防防止止灭
15、灭菌菌时时冷冷凝凝水水润润湿湿棉棉塞塞，其其外外再再用用一一道道麻麻绳绳扎扎好好。用用记记号号笔笔注注明明培培育育基基名名称、组别、日期。称、组别、日期。u三三角角烧烧瓶瓶加加塞塞后后，外外包包牛牛皮皮纸纸，用用麻麻绳绳以以活活结结形形式式扎扎好好，运运用用时时简简洁洁解解开开，同同样样用用记记号号笔笔注注明明培培育基名称、组别、日期。育基名称、组别、日期。8、灭、灭 菌菌u将上述培育基以将上述培育基以121，20分钟高压蒸汽灭菌。分钟高压蒸汽灭菌。u如如因因特特殊殊状状况况不不能能刚刚好好灭灭菌菌，则则应应放放入入冰冰箱箱内内暂暂存。存。9、搁置斜面、搁置斜面uu将将将将灭灭灭灭菌菌菌菌的的
16、的的试试试试管管管管培培培培育育育育基基基基冷冷冷冷至至至至5050左左左左右右右右，将将将将试试试试管管管管棉棉棉棉塞塞塞塞端端端端搁搁搁搁在在在在玻玻玻玻棒棒棒棒上上上上，搁搁搁搁置置置置的的的的斜斜斜斜面面面面长长长长度度度度不不不不要要要要超超超超过过过过试试试试管总长的一半。管总长的一半。管总长的一半。管总长的一半。10、无菌检查、无菌检查uu为为为为检检检检查查查查灭灭灭灭菌菌菌菌是是是是否否否否彻彻彻彻底底底底，需需需需将将将将灭灭灭灭菌菌菌菌的的的的培培培培育育育育基基基基放放放放入入入入3737的温室中培育的温室中培育的温室中培育的温室中培育24-4824-48小时。小时。小
17、时。小时。（二二）马马铃铃薯薯(PDA)(PDA)培培育育基基的的制制备备(真真菌菌用用)马铃薯马铃薯 200g 蒸馏水蒸馏水 1000mL蔗糖（葡萄糖）蔗糖（葡萄糖）20g pH 自然自然 琼脂琼脂 20gu马马铃铃薯薯汁汁制制备备：将将马马铃铃薯薯去去皮皮，称称量量所所需需重重量量，切成小块，加水煮沸切成小块，加水煮沸30min。u用用滤滤纸纸或或双双层层纱纱布布(中中间间夹夹一一层层脱脱脂脂棉棉花花)趁趁热热过滤。过滤。u滤滤液液煮煮沸沸后后加加糖糖，用用于于培培育育霉霉菌菌的的加加入入蔗蔗糖糖，用于培育酵母菌的加入葡萄糖，再加入其它。用于培育酵母菌的加入葡萄糖，再加入其它。u其余同牛肉
18、膏蛋白胨培育基的制备。其余同牛肉膏蛋白胨培育基的制备。（三）高氏（三）高氏I I号培育基的制备号培育基的制备(放线菌菌用放线菌菌用)可溶性淀粉可溶性淀粉 20g KNO3 1gNaCl 0.5g K2HPO43H2O 0.5gMgSO47H2O 0.5g FeSO47H2O 0.01g琼脂琼脂 20g 水水 1000mLpH u按按配配方方先先称称取取可可溶溶性性淀淀粉粉，放放入入小小烧烧杯杯中中，并并用用少少量量冷冷水水将将淀淀粉粉调调成成糊糊状状，再再加加入入少少于于所所需需水水量量的的沸沸水水，接接着着加加热热，使使可可溶溶性性淀淀粉粉完完全全熔熔化化，然然后后再再称称取其各成分依次熔化
19、。取其各成分依次熔化。u对对微微量量成成分分FeSO47H2O，可可先先在在100mL水水中中加加入入1g的的FeSO47H2O，配配成成0.01g/mL，再再在在10000mL培育基中加培育基中加1mL的的0.01g/mL的贮备液。的贮备液。u其它同牛肉膏蛋白胨培育基的配置。其它同牛肉膏蛋白胨培育基的配置。留意事项！留意事项！u（1）在制备固体培育基加热溶化琼脂时要不断搅拌，）在制备固体培育基加热溶化琼脂时要不断搅拌，u 避开琼脂糊底烧焦。避开琼脂糊底烧焦。u（2）液体培育基：分装高度以试管的）液体培育基：分装高度以试管的1/4左右为宜。左右为宜。u（3）固体培育基：分装试管，其装量为管高的
20、）固体培育基：分装试管，其装量为管高的1/61/5 u 灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量以一半为宜。灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量以一半为宜。u（4）半固体培育基：分装试管一般以试管高度的）半固体培育基：分装试管一般以试管高度的1/3为为u 宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。u（5）不要使培育基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干）不要使培育基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干u 净的纱布擦干净。净的纱布擦干净。三、培育基配制任务安排三、培育基配制任务安排 全班同学共分成全班同学共分成4组，每组组，每组7人人一组完成马铃薯一组完成马铃薯(PDA)培育基（霉菌用，用
21、蔗糖），培育基（霉菌用，用蔗糖），二组完成马铃薯二组完成马铃薯(PDA)培育基（酵母菌用，用葡萄糖），培育基（酵母菌用，用葡萄糖），三组完成高氏三组完成高氏I号培育基（用于放线菌培育），号培育基（用于放线菌培育），四组完成牛肉膏蛋白胨培育基（用于细菌培育）。四组完成牛肉膏蛋白胨培育基（用于细菌培育）。每每组组的的培培育育基基均均配配制制成成1000mL，分分装装4个个三三角角瓶瓶（150mL），其余分装试管做成斜面。其余分装试管做成斜面。三、培育基配制任务安排三、培育基配制任务安排 全班同学共分成全班同学共分成4组，每组组，每组7人人试试 管：管：2支支/人（人（5支装支装9ml蒸馏水，其余装
22、培育基），蒸馏水，其余装培育基），培育皿：培育皿：1套套/人，人，吸吸 管：管：1支支/人，人，三三角角瓶瓶：5瓶瓶/组组（1瓶瓶装装90ml蒸蒸馏馏水水，4瓶瓶装装150ml培培育育基），基），四、灭菌任务四、灭菌任务分装好的培育基分装好的培育基装有玻璃珠的三角瓶装入装有玻璃珠的三角瓶装入90mL自来水自来水1瓶瓶/组组湿湿热热灭灭菌菌干干热热灭灭菌菌移液管移液管 1支支/人人培育皿培育皿 1包包/组组五、思索题及作业题五、思索题及作业题u1、培育微生物的培育基应具备哪些条件？、培育微生物的培育基应具备哪些条件？u2、为什么培育基配制好后必需马上灭菌？、为什么培育基配制好后必需马上灭菌？u3、在培育基中，琼脂有何作用？它有哪些特性？、在培育基中，琼脂有何作用？它有哪些特性？u4、为什么干热灭菌比湿热灭菌所须要的温度高、为什么干热灭菌比湿热灭菌所须要的温度高、u 时时间间长长？请请设设计计干干热热灭灭菌菌和和湿湿热热灭灭菌菌效效果果比比较较u 试验方案。试验方案。