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1、基因操作的技术原理电泳第一页，讲稿共二十六页哦4.1核酸的凝胶电泳 1定义：定义：用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳等作为支持介质的区用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。带电泳法称为凝胶电泳。v琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳适用于分离大分子核酸。适用于分离大分子核酸。v聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳普遍用于分离蛋白质及普遍用于分离蛋白质及较小分子质量的核酸较小分子质量的核酸第二页，讲稿共二十六页哦 2 2 基本原理基本原理 带有负电荷的带有负电荷的DNA或或RNA核苷酸链，依靠核苷酸链，依靠无无反应活性反应活性的稳定的支持介质和缓冲液，在电场的稳定的支持介质和缓冲
2、液，在电场中以一定的迁移率从中以一定的迁移率从负负极移向极移向正正极。极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将核异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将核酸分子混合物中的各种成分彼此分开。酸分子混合物中的各种成分彼此分开。第三页，讲稿共二十六页哦3 3 电泳的迁移率电泳的迁移率电泳迁移率取决于核酸分子本身的电泳迁移率取决于核酸分子本身的大小大小和和构型构型 1 1 分子量小的分子量小的DNA分子分子 分子量大的分子量大的DNA分子分子 线状双链线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的
3、迁移速率与DNA分子量对数成反比分子量对数成反比,分分子越大则所受阻力越大子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。因而迁移得越慢。2 2 同等分子量的不同构型的核酸分子同等分子量的不同构型的核酸分子 共价闭环共价闭环 线性线性 松散型的开环松散型的开环相同分子量的质粒其线状、开环和超螺旋相同分子量的质粒其线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的的。第四页，讲稿共二十六页哦4凝胶电泳的分辨力凝胶电泳的分辨力 与凝胶的与凝胶的类型类型和和浓度浓度相关相关 琼脂糖凝胶的分辨力在琼脂糖凝胶的分辨力在0.160
4、Kb之间之间;聚丙烯酰胺的分辨力在聚丙烯酰胺的分辨力在1bp1Kb之间之间 凝胶浓度越大相对分离的凝胶浓度越大相对分离的DNA片段越小片段越小凝胶浓度越小相对分离的凝胶浓度越小相对分离的DNA片段越大片段越大第五页，讲稿共二十六页哦 琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取出的琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取出的线性多糖聚合物。线性多糖聚合物。一一琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳包括：包括：常熔点的琼脂糖常熔点的琼脂糖低熔点（低熔点（LMP）琼脂糖）琼脂糖第六页，讲稿共二十六页哦LMP琼脂糖琼脂糖性质：熔点：性质：熔点：6265在在37可保持液态数小时；可保持液态数小时；在在25可保持液态约可保持
5、液态约10分钟分钟用途：回收用途：回收DNADNA分子分子 在在65 65 下将下将LMPLMP琼脂糖凝胶熔化；琼脂糖凝胶熔化；加入过量的酚抽提加入过量的酚抽提DNADNA；离心获得含离心获得含DNADNA分子的上清液；分子的上清液；特点：直接酶切特点：直接酶切 ；价格昂贵；价格昂贵第七页，讲稿共二十六页哦1琼脂糖凝胶电泳的参数：琼脂糖凝胶电泳的参数：（1）缓冲液缓冲液（2）凝胶的浓度凝胶的浓度（3）加加DNA样品：样品：1g，载样缓冲液，载样缓冲液(溴酚蓝，甘油溴酚蓝，甘油）（4）电泳条件电泳条件（5）染色和观察染色和观察 第八页，讲稿共二十六页哦（1）缓冲液：常用的几种电泳缓冲液有：常用的
6、几种电泳缓冲液有：TAETris-乙酸和乙酸和EDTA(pH8.0)TBE(Tris-硼酸和硼酸和EDTA)TPE(Tris-磷酸和磷酸和EDTA)一般配制成浓缩母液（一般配制成浓缩母液（10X或或5X）,储于室温储于室温。第九页，讲稿共二十六页哦TAE、TBE和和TPE比较比较Buffer缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE第十页，讲稿共二十六页哦（2 2）琼脂糖浓度琼脂糖浓度与与DNA分子大小分子大小的关系的关系DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性
7、关系。分离的分离的DNA片段片段0.5kb所需胶浓度是所需胶浓度是1.2-1.5%,分离的分离的DNA片段片段10kb所需胶浓度为所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所片段大小间于两者之间则所需胶浓度为需胶浓度为0.8-1.0%。第十一页，讲稿共二十六页哦（4）电泳条件电泳条件 在低电压时在低电压时,线状线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的不同分子量的DNA片段的片段的迁移率将以不同的幅度增长迁移率将以不同的幅度增长,片段越大片段越大,因场强升高引起因场强升高引起的迁移率升高幅
8、度也越大的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加因此电压增加,琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。有效分离范围将缩小。大片断低电压长时间大片断低电压长时间小片段高电压短时间小片段高电压短时间第十二页，讲稿共二十六页哦（5）染色和观察：染色和观察：溴化乙锭（溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）染色，）染色，溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强。使其刚性更强。1常用的核酸染色剂是溴化乙锭（常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），），
9、染色效果好，染色效果好，操作方便，但是稳定性差，操作方便，但是稳定性差，具有具有毒性，致癌作用毒性，致癌作用。2SYBRGreen，GelRed毒性小，但价格贵。毒性小，但价格贵。3GeneGreen相比则是性价比高的低毒相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统替代染料，其灵敏度比传统EB染料高染料高10倍以上。倍以上。溴化乙锭染料分子的化学结构及其对溴化乙锭染料分子的化学结构及其对DNA分分子的插入作用子的插入作用第十三页，讲稿共二十六页哦 用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算 第十四页，讲稿共二十六页哦第十五页，讲稿共二十六页哦第十六页，讲稿共二十六页哦第十七页，讲稿共二十
10、六页哦琼脂糖凝胶电泳的操作步骤 v1.根据欲分离根据欲分离DNA片段大小用配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到片段大小用配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。缓冲液体积应小于容器容积的盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。缓冲液体积应小于容器容积的50%。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。v2待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭（枪头沾取少许即可）。轻轻地旋转以待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭（枪头沾取少许即可）。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。充分混匀凝胶溶液。v3.琼脂糖溶液正在冷却时，
11、用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置在托盘底面上琼脂糖溶液正在冷却时，用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置在托盘底面上0.51.0mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。v4.浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。凝胶适宜厚度为浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。凝胶适宜厚度为35mm。v5.让凝胶溶液完全凝结，室温下让凝胶溶液完全凝结，室温下20-30min。小心拔出梳子。将凝胶安放到电泳小心拔出梳子。将凝胶安放到电泳槽内。槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液向电泳槽加入电泳缓冲液。第十八页，讲稿共二十六页哦v6.混合混合DNA样品和样品和0.2倍体
12、积倍体积6指示剂。指示剂。v7.用微量移液器将样品混合液用微量移液器将样品混合液缓慢缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。v8.关上电泳槽盖，接好电极插头。给予合适的电压。关上电泳槽盖，接好电极插头。给予合适的电压。v9.当当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电极插样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔出电极插头和打开电泳槽盖头和打开电泳槽盖.v10.转移凝胶至凝胶成像系统内观察。转移凝胶至凝胶成像系统内观察。vhttp:/ 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚
13、丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，简称，简称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法为支持介质的电泳方法 PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等制备，还可测定分子量、等电点等第二十二页，讲稿共二十六页哦蛋白分子量与聚丙烯酰胺凝胶浓度对应关系蛋白分子量与聚丙烯酰胺凝胶浓度对应关系第二十三页，讲稿共二十六页哦 SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺是为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择Tris-HCL系统。TEMED与AP(催化剂)：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固。十二烷基磺酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白 质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白 分子内的疏水作用、去多肽折叠。第二十四页，讲稿共二十六页哦第二十五页，讲稿共二十六页哦第二十六页，讲稿共二十六页哦