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1、微生物实验四现在学习的是第1页，共20页【目的要求】学习并了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。了解革兰氏染色法的原理，并掌握其操作方法。了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。巩固显微镜(油镜)的使用方法。现在学习的是第2页，共20页【基本原理】一、细菌的涂片及简单染色法基本原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。现在学习的是
2、第3页，共20页【基本原理】用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。现在学习的是第4页，共20页【基本原理】二、革兰氏染色法（经典法）基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。现在学
3、习的是第5页，共20页【实验用品】1、菌种 金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌（注：大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球状细菌，经过革兰氏染色，两者着上不同颜色，在显微镜下便于区别。同时，由于两者具有不同的个体形态，在对它们的混合涂片进行革兰氏染色后，根据菌体颜色和形态差异，可以判断染色是否成功。）2、仪器 显微镜(25台)；3、材料 载玻片（每组4个），酒精灯（每组1个），接种环（每组1个），擦镜纸，二甲苯、香柏油，吸水纸，染色缸等；现在学习的是第6页，共20页【实验用品】4、染料 草酸铵结晶紫（Crystal Violet,CV）、沙黄、吕氏碱性美蓝染液。1）草酸铵结晶紫染
4、液的配制：A液：结晶紫2g 95乙醇 20mlB液：草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml需在用前48h将A液、B液混合，装入棕色试剂瓶内备用。现在学习的是第7页，共20页【实验用品】2）沙黄染液的配制：A.贮存液：沙黄2.5g 95乙醇100ml B.应用液：A液10ml蒸馏水90m现在学习的是第8页，共20页【实验用品】3）吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 A液：美蓝(methylene blue)0.6g 95%酒精 30mlB液：KOH 0.01g 蒸馏水 100ml分别配制A液和B液，配好后混合即可。现在学习的是第9页，共20页【方法步骤】一、细菌的涂片及简单染色法涂片涂片固定固定染
5、色染色水洗水洗干燥干燥镜检镜检 清理清理干燥干燥现在学习的是第10页，共20页【方法步骤】图1 涂片、干燥和热固定现在学习的是第11页，共20页【方法步骤】二、革兰氏染色法（经典法）1、涂片 在洁净无油腻的玻片滴两小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，两种细菌要混合的地方。2、固定 将制成的涂片自然干燥，冷却后固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。现在学习的是第12页，共20页【方法步骤】3、染色初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。媒染 滴加
6、(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。脱色 滴加95%乙醇2-3次，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。（此步至关重要）。复染 滴加0.5%沙黄，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。现在学习的是第13页，共20页【方法步骤】4、镜检 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。右图为革兰氏染色法显示的炭疽和金黄色葡萄球菌现在学习的是第14页，共20页【方法步骤】现在学习的是第15页，共20页【注意事项】难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰
7、氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。选用对数生长期的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。现在学习的是第16页，共20页【实验报告】1结果1）绘出油镜下观察的菌体图像 革兰氏染色效果 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 混合菌现在学习的是第17页，共20页【注意事项】玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。制片要完全干燥后才能用油镜观察。革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，现在学习的是第18页，共20页2）填表 表1 细菌形态的描述【实验报告】现在学习的是第19页，共20页【实验报告】2思考题（1）涂片为什么要固定，固定时应注意什么问题？（2）你在涂片染色过程中遇到了什么问题？试分析其中原因？（3）革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如何控制这一步。（4）不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？现在学习的是第20页，共20页