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1、微生物实验四微微生物实验四微生物实验生物实验第1页，本讲稿共19页一、一、目的要求目的要求 1 1、识识别别细细菌菌的的形形态态特特征征（观观察察细细菌菌的的形形态态、大大小小、色色泽泽、透透明明度和边缘特征。度和边缘特征。2 2、掌掌握握细细菌菌涂涂片片方方法法及及革革兰兰氏氏染染色色步步骤骤，并并在在显显微微镜镜下观察细菌的形态。下观察细菌的形态。3.3.学习巩固显微镜操作技术及无菌操作技术学习巩固显微镜操作技术及无菌操作技术第2页，本讲稿共19页二、二、基本原理基本原理 第3页，本讲稿共19页革兰氏染色革兰氏染色 结晶紫、碘液媒染结晶紫、碘液媒染时，由于细胞壁带负电荷、吸收碱时，由于细胞
2、壁带负电荷、吸收碱性染料，性染料，G G ，G G和都吸收碱性染料，在细胞结合和都吸收碱性染料，在细胞结合结结晶紫碘液复合物晶紫碘液复合物。第4页，本讲稿共19页v 酒精脱色酒精脱色时，时，G G菌细胞壁厚，含有较厚的菌细胞壁厚，含有较厚的肽聚糖，又由于有短肽作肽桥且短肽几乎都肽聚糖，又由于有短肽作肽桥且短肽几乎都相连，肽聚糖的强度高，整个细胞壁结构紧相连，肽聚糖的强度高，整个细胞壁结构紧密，因此遇酒精时，结晶紫碘液阻留在细胞密，因此遇酒精时，结晶紫碘液阻留在细胞壁内；壁内；v G G 酒精使外膜类脂溶解酒精使外膜类脂溶解，只剩肽聚糖层，只剩肽聚糖层，而而G G 肽聚糖层薄而松散，不能阻挡复合
3、物肽聚糖层薄而松散，不能阻挡复合物逸出，细胞壁变成无色，逸出，细胞壁变成无色，第5页，本讲稿共19页 再用红色染料复染，则再用红色染料复染，则G G因已结合因已结合紫色染料紫色染料难以吸咐红色染料，成难以吸咐红色染料，成紫色紫色或结合微量红色染料而成或结合微量红色染料而成紫红色紫红色。而。而G G 菌则重新吸附红色染料菌则重新吸附红色染料由无色变由无色变红色红色。第6页，本讲稿共19页Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌Escherichia coliEscherichia coli大肠杆菌
4、大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌革革兰兰氏氏染染色色 示示意意图图步骤步骤G菌菌 G菌菌 1.固定固定2.结晶紫结晶紫3.碘液碘液5.沙黄沙黄4.脱色脱色杂色杂色杂色杂色文字文字文字文字第7页，本讲稿共19页阳性菌阳性菌阴性菌阴性菌革兰氏染色法革兰氏染色法第8页，本讲稿共19页三、三、实验材料实验材料（一）药品（一）药品 生生理理盐盐水水 结结晶晶紫紫染染液液 卢卢戈戈氏氏碘碘液液 95%95%乙乙醇醇 蕃蕃红红（复复红红）香香柏柏油油 二甲苯二甲苯（二）菌种（二）菌种 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 大肠杆菌大肠杆菌 第一大组自制菌种第一大组自制菌种 （三）其它物品（三）其它物品显微镜显微镜 擦镜纸擦镜纸
5、 载玻片载玻片 吸水纸吸水纸 盖玻片盖玻片第9页，本讲稿共19页四、四、实验内容实验内容1.1.大肠杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、自接菌种（可疑细菌）革兰枯草芽孢杆菌、自接菌种（可疑细菌）革兰 氏染色。氏染色。涂片涂片、干燥、固定、干燥、固定结晶紫初染结晶紫初染1 1分钟，水洗分钟，水洗碘液碘液 （媒染）冲去残水并覆盖（媒染）冲去残水并覆盖1 1分钟，水洗分钟，水洗95%95%的的乙醇脱色乙醇脱色 30 30秒，水洗秒，水洗蕃红复染蕃红复染1-21-2分钟，水洗分钟，水洗干燥，干燥，油镜油镜观察观察前进前进前进前进第10页，本讲稿共19页2.2.观察大肠杆菌、观察大肠杆菌、枯草芽孢杆菌枯草芽孢
6、杆菌 、自接菌种的、自接菌种的细胞形态，细胞形态，画图画图。红色红色 G菌菌 红色红色 G+菌菌 第11页，本讲稿共19页干燥、固定干燥、固定v先用吸水纸吸去部分水珠，菌面朝上，用酒先用吸水纸吸去部分水珠，菌面朝上，用酒精灯的外焰部分干燥。以手背面不感觉烫，精灯的外焰部分干燥。以手背面不感觉烫，看不到明显的液体为宜。看不到明显的液体为宜。第14页，本讲稿共19页v初染：初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色染色1-2min 1-2min 钟后倾去染液，水洗至流出水无钟后倾去染液，水洗至流出水无色。色。v媒染：媒染：先用卢戈氏碘冲去水迹，再用碘液覆先用卢戈氏碘冲去水迹，再用碘液覆盖盖1min1min倾去碘液，水洗至流出水无色。倾去碘液，水洗至流出水无色。第15页，本讲稿共19页五、实验结果和思考题五、实验结果和思考题1.1.绘出油镜下观察的三种菌株的图像，表明菌绘出油镜下观察的三种菌株的图像，表明菌体的颜色，判断其革兰氏阳性还是阴性。体的颜色，判断其革兰氏阳性还是阴性。第18页，本讲稿共19页v2.2.思考题思考题v革兰氏染色是否成功有哪些问题需要注意，革兰氏染色是否成功有哪些问题需要注意，为什么？为什么？第19页，本讲稿共19页