保健食品功效成分检测方法.pdf

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1、分光光度法分光光度法分光光度法分光光度法 测定保健食品功效成分仓公敖仓公敖仓公敖仓公敖YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.保健食品的原料保健食品的原料与与功效成分功效成分2.2.2.2.保健食品的功效成分保健食品的功效成分与与保健功能保健功能3.3.3.3.保健食品功效成分的保健食品功效成分的检测检测4.4.4.4.检测检测方法的技方法的技术术要求及要求及数数据据处处理理内内 容容YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR

2、 SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖保健功效成分来源与保健功能保健功效成分来源与保健功能功效成分功效成分 灵芝多糖香菇多糖 硫酸软骨素 保健功能保健功能 缓解体力疲劳增强免疫力辅助降血糖辅助降血脂 辅助降血脂增强免疫力保护骨关节参与制造骨骼 主要来源主要来源 灵芝、香菇、枸杞、银耳、灰树花、人参、西洋参、昆布、木耳、山药、黄芪、茯苓、猪苓、黄精、苦瓜 动物的软骨 YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖

3、的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 测定原理测定原理 -多糖经乙醇沉淀分离后，去除其他可溶性糖及杂质的干多糖经乙醇沉淀分离后，去除其他可溶性糖及杂质的干扰，再与苯酚扰，再与苯酚硫酸作用成橙红色化合物，其呈色度与溶硫酸作用成橙红色化合物，其呈色度与溶液中的糖的浓度成正比，在液中的糖的浓度成正比，在485nm485nm波长下比色定量波长下比色定量YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多

4、多 糖糖一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 样品处理样品处理 由于不少保健品添加了淀粉、糊精，一定要做相应的处由于不少保健品添加了淀粉、糊精，一定要做相应的处理，否则结果偏高。添加淀粉的样品需加理，否则结果偏高。添加淀粉的样品需加-淀粉酶及糖化淀粉酶及糖化酶（如葡萄糖苷酶）处理。添加糊精的样品需加糖化酶酶（如葡萄糖苷酶）处理。添加糊精的样品需加糖化酶（如葡萄糖苷酶）处理。（如葡萄糖苷酶）处理。处理的原则是将这类非活性多糖的碳水化合物全部酶解处理的原则是将这类非活性多糖的碳水化合物全部酶解成单糖或低聚糖，再用乙醇沉淀所需的活性多糖以达到分成单糖或低聚糖，再用乙醇沉

5、淀所需的活性多糖以达到分离的目的。离的目的。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 样品测定样品测定 定量准确移取样品溶液于定量准确移取样品溶液于25mL25mL比色管中，补加水至比色管中，补加水至2.0mL,2.0mL,加入加入5%5%苯酚溶液苯酚溶液1.0mL,1.0mL,在旋涡混合器上混匀，小心在旋涡混合器上混匀，小心加入浓硫酸加入浓硫酸10mL,10mL,在旋涡混

6、合器上小心混匀，至沸水浴中在旋涡混合器上小心混匀，至沸水浴中2min2min，冷却至室温，用分光光度计在，冷却至室温，用分光光度计在485nm485nm波长处以试剂空波长处以试剂空白为参比，白为参比，1cm1cm比色皿测定吸光度值。比色皿测定吸光度值。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 注意事项注意事项测定样品中多糖时，提取时间以1小时为宜，以免因提取时间过长引起糖结构变化甚至使碳

7、键断裂而导致所测多糖含量偏低本法灵敏度高，出现测定结果平行性偏差较大,实际操作时每个样品要多做几个平行样由于保健食品组方的复杂性，不同分子量得多糖所用的乙醇浓度沉淀效果是不同的酶的活性对酶解的效果影响较大粗多糖测定最终报告结果要标示以葡萄糖计或葡聚糖计，因两者测定值相差很大一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 测定原理

8、测定原理 -食品中相对分子质量大于食品中相对分子质量大于1 1*104104的高分子物质在的高分子物质在80%80%乙醇溶乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚多糖，用苯酚硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算食品中粗多糖的含量。算食品中粗多糖的含量。YOUR SITE HEREYO

9、UR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 样品处理样品处理 1 1）样品提取）样品提取 2 2）沉淀粗多糖）沉淀粗多糖 3 3）沉淀葡聚糖）沉淀葡聚糖YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 样品处理样品处理 样

10、样品提取品提取 称取混合均匀的固体样品称取混合均匀的固体样品2.0g,2.0g,置于置于100ml100ml，加水，加水80ml80ml左左右，于沸水浴上加热右，于沸水浴上加热2 2小时、冷却至室温后补加水至刻小时、冷却至室温后补加水至刻度，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖度，混匀后过滤，弃去初滤液，收集余下滤液供沉淀多糖YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 样品处理样

11、品处理 沉淀粗多糖沉淀粗多糖 准确吸取样品提取中终滤液准确吸取样品提取中终滤液5.0ml5.0ml或液体样品或液体样品5.0ml5.0ml，置，置于于50ml50ml离心管中，加入无水乙醇离心管中，加入无水乙醇20ml20ml，混匀，混匀5min5min后，以后，以3000r/min3000r/min离心离心5min5min，弃去上清液。残渣用，弃去上清液。残渣用80%(80%(体积分数）体积分数）乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作乙醇溶液数毫升洗涤，离心后弃上清液，反复操作3-43-4次。次。残渣用水溶解并定容至残渣用水溶解并定容至5.0ml5.0ml，混匀后供沉淀葡聚糖。，混匀后

12、供沉淀葡聚糖。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 样品处理样品处理 沉淀葡聚糖沉淀葡聚糖 准确吸取沉淀粗多糖后的终溶液准确吸取沉淀粗多糖后的终溶液2ml2ml，置于，置于20ml20ml离心管离心管中，加入中，加入100g/l100g/l氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液2.0ml2.0ml、铜试剂溶液、铜试剂溶液2.0ml2.0ml，沸水浴中煮沸沸水浴中煮沸2min2min，冷却，以，冷却

13、，以3000r/min3000r/min离心离心5min,5min,弃去上弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作复操作3 3次，残渣用次，残渣用10%10%（体积分数）硫酸溶液（体积分数）硫酸溶液2.0ml2.0ml溶解溶解并转移至并转移至50ml50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液为样品测定液。为样品测定液。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的

14、多糖的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 样品测定样品测定 准确吸取样品测定液准确吸取样品测定液2.0mL2.0mL，置于，置于25mL25mL比色管中，加入比色管中，加入50g/L50g/L苯酚溶液苯酚溶液1.0mL,1.0mL,在旋涡混合器上混匀，小心加入浓硫在旋涡混合器上混匀，小心加入浓硫酸酸10.0mL,10.0mL,在旋涡混合器上小心混匀，至沸水浴中在旋涡混合器上小心混匀，至沸水浴中2min2min，冷，冷却至室温，用分光光度计在却至室温，用分光光度计在485nm485nm波长处以试剂空白为参波长处以试剂空白为参比，比，1cm1cm比色皿测

15、定吸光度值。比色皿测定吸光度值。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 注意事项注意事项本方法测定的水溶性多糖含有10个以上单糖残基在测定过程中应避免糖和其他碳水化合物的污染，因为苯酚硫酸与糖和碳水化合物起反应某些保健食品中功效成分为醇溶性多糖，可参照本方法进行测定，但样品预处理时将乙醇改为丙酮即可洗涤粗多糖沉淀时，一定要将离心管壁上玷污的其他糖分和碳水化合物用80%乙醇洗净，否则结果

16、偏高此法适用于测定高分子量的糖类物质（10000Da）YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖三、硫酸软骨素的分光光度测定法三、硫酸软骨素的分光光度测定法 测定原理测定原理 -结晶紫是一种阳离子染料，在酸性条件下带正电荷，易与结晶紫是一种阳离子染料，在酸性条件下带正电荷，易与带酸性基团的生物大分子发生静电作用而形成离子配合带酸性基团的生物大分子发生静电作用而形成离子配合物，已用于脱氧核糖核酸、干扰素等的分光光度法分析。物，已用于脱氧核糖核

17、酸、干扰素等的分光光度法分析。结晶紫结构中的氨基带正电荷，硫酸软骨素的磺酸基和羧结晶紫结构中的氨基带正电荷，硫酸软骨素的磺酸基和羧基带负电荷，两者通过静电引力和输水作用力形成络合基带负电荷，两者通过静电引力和输水作用力形成络合物，产生变色效应，吸光度降低。吸光度的降低量与硫酸物，产生变色效应，吸光度降低。吸光度的降低量与硫酸软骨素含量线性相关软骨素含量线性相关YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖三、硫酸软骨素的分光光度测定法三、硫酸软

18、骨素的分光光度测定法 样品处理样品处理 精密称取内容物精密称取内容物25mg25mg，置于，置于100mL100mL量瓶中，加水适量，量瓶中，加水适量，超声处理超声处理10min10min，加水定容至，加水定容至100mL,100mL,过滤，取续滤液过滤，取续滤液4mL,4mL,置置于于100mL100mL量瓶中，加水至刻度，得样品溶液量瓶中，加水至刻度，得样品溶液。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖三、硫酸软骨素的分光光度测定法三

19、、硫酸软骨素的分光光度测定法 样品测定样品测定 取供试品溶液取供试品溶液1mL1mL，置于，置于10mL10mL具塞刻度试管中，加入具塞刻度试管中，加入pH5.0pH5.0的醋酸的醋酸醋酸钠缓冲液醋酸钠缓冲液1.0mL1.0mL和结晶紫并粗三溶液和结晶紫并粗三溶液0.6mL0.6mL，加水至，加水至10.0mL10.0mL，摇匀，摇匀，3030水浴保温水浴保温20min,20min,放至室放至室温。以水为参比，于温。以水为参比，于588nm588nm波长下测定吸光度。波长下测定吸光度。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HER

20、ELOGOLOGOLOGOLOGO1.1.1.1.多糖的多糖的检测检测方法方法多多 糖糖三、硫酸软骨素的分光光度测定法三、硫酸软骨素的分光光度测定法 注释注释 硫酸软骨素是提取于动物软骨的黏多糖类物质，在心血管疾病、关节病的防治等方面具有重要作用。硫酸软骨素除了作为药用品外，大量的是作为改善关节病的补充品，作为健康食品应用，在美国已经风行多年，经过多年的应用，已经证明硫酸软骨素对改善老年退行性关节炎、风湿性关节炎有一定的效果。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO2.2.2.2.皂苷类皂苷

21、类化合物的化合物的检测检测方法方法皂苷类皂苷类保健功效成分来源与保健功能保健功效成分来源与保健功能功效成分功效成分 保健功能保健功能 主要来源主要来源 红景天苷红景天苷人参皂苷人参皂苷缓解体力疲劳、缓解体力疲劳、增强免疫力、增强免疫力、抗氧化、抗辐射、抗氧化、抗辐射、提高缺氧耐受力、提高缺氧耐受力、辅助降血糖、辅助降血糖、保护心血管系统保护心血管系统人参、西洋参、红景天、绞股蓝人参、西洋参、红景天、绞股蓝YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO2.2.2.2.皂苷类皂苷类化合物的化合物的检测

22、检测方法方法多多 糖糖一、总皂苷的分光光度测定法、总皂苷的分光光度测定法 测定原理测定原理 -总皂苷经提取、总皂苷经提取、PTPT大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条件下，香草醛与人参皂苷生成有色化合物，以人参皂苷件下，香草醛与人参皂苷生成有色化合物，以人参皂苷ReRe为对照品，于为对照品，于560nm560nm处比色测定。处比色测定。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO2.2.2.2.皂苷类皂苷类化合物的化合物的检测检测方法方法多多 糖糖一、粗多糖的苯酚、粗

23、多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 样品处理样品处理1 1）固体样品：称取）固体样品：称取1.0g1.0g左右样品置于左右样品置于100mL100mL烧杯中，加入烧杯中，加入2040mL85%2040mL85%乙醇，超声波振荡乙醇，超声波振荡30min30min，再定容至，再定容至50mL,50mL,摇摇匀，放置，吸取上清液匀，放置，吸取上清液1.0mL,1.0mL,挥干后以水溶解残渣，进行挥干后以水溶解残渣，进行柱分离。柱分离。2)2)液体样品：含乙醇的酒类样品：准确吸取液体样品：含乙醇的酒类样品：准确吸取1.0mL1.0mL样品放于蒸样品放于蒸发皿中，蒸干，用水溶解残渣，用此液

24、进行柱层析。非乙发皿中，蒸干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析。非乙醇类液体样品：准确吸取醇类液体样品：准确吸取1.0mL1.0mL样品（如浓度高或颜色深，样品（如浓度高或颜色深，需稀释一定体积后再取需稀释一定体积后再取1.0mL1.0mL）,直接进行柱分离。直接进行柱分离。一、总皂苷的分光光度测定法、总皂苷的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO2.2.2.2.皂苷类皂苷类化合物的化合物的检测检测方法方法多多 糖糖一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测

25、定法 样品处理样品处理 柱层析：以柱层析：以PTPT大孔吸附树脂柱进行层析分离，准确吸取大孔吸附树脂柱进行层析分离，准确吸取上述已处理好的样品溶液上述已处理好的样品溶液1.0mL1.0mL上柱，用上柱，用15mL15mL水洗柱，以洗水洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，再用去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，再用20mL85%20mL85%乙醇洗脱乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，于水浴上蒸干，以此作总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，于水浴上蒸干，以此作显色用。显色用。一、总皂苷的分光光度测定法、总皂苷的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE

26、 HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO2.2.2.2.皂苷类皂苷类化合物的化合物的检测检测方法方法多多 糖糖一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 样品测定样品测定 显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加入显色：在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL5%0.2mL5%香草醛冰香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加入乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加入0.8mL0.8mL高氯高氯酸，混匀后移入酸，混匀后移入10mL10mL比色管中，塞紧盖子，于比色管中，塞紧盖子，于6060以下水以下水浴加温浴加温15min15min取出，冷却

27、后准确加入冰乙酸取出，冷却后准确加入冰乙酸5.0mL5.0mL，摇匀后，摇匀后以以1.0cm1.0cm比色皿与比色皿与560nm560nm处与人参皂苷处与人参皂苷ReRe标准管同时比色标准管同时比色。一、总皂苷的分光光度测定法、总皂苷的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO2.2.2.2.皂苷类皂苷类化合物的化合物的检测检测方法方法多多 糖糖二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 注释注释(1)人参系五加科植物人参panax ginseng C A Meycr的

28、根，含有多种人参皂苷（ginsenoside），多数为达玛烷型皂苷，如人参皂苷Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd等，少数为齐墩果酸型（C型）皂苷、如人参皂苷Re，由于苷元不同，达玛烷型皂苷又分为20S-原人参二醇类皂苷（A型）和20S-原人参三醇类皂苷（B型）。A型和B型皂苷酸水解后，分别得到人参二醇（panaxadial）和人参三醇（panaxatriol）。除人参外，五加科的西洋参、三七、刺人参、刺五加和葫芦科的绞股蓝中亦含有与人参皂苷类似的化合物。当保健食品原料配方中含有上述多种原料时，即以本法“总皂苷（以人参皂苷Re计）”报告检测结果。（2）对于人参、西洋参、绞股蓝纯品或者以

29、其为主要原料加工的保健食品，按中华人民共和国药典，以薄层色谱法进行鉴定试验，将受试品色谱与对照药材色谱及对照进行比较确定其主要原料后，人参、西洋参制品仍以人参皂苷Re为对照品进行检测、而绞股蓝制品以绞股蓝总皂苷（中国药品生物制品鉴定所）为对照品进行检测，分别以“人参总皂苷”、“西洋参总皂苷”报告检测结果。（3）回收率：90%105%。一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法一、总皂苷的分光光度测定法、总皂苷的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO3.

30、3.3.3.黄酮类黄酮类化合物的化合物的检测检测方法方法黄酮类黄酮类保健功效成分来源与保健功能保健功效成分来源与保健功能功效成分功效成分 保健功能保健功能 主要来源主要来源 银杏黄酮银杏黄酮山楂黄酮山楂黄酮辅助降血脂、辅助降血脂、提高缺氧耐受力、提高缺氧耐受力、抗氧化、抗氧化、增强免疫力、增强免疫力、保护心血管系统、保护心血管系统、保护脑神经系统保护脑神经系统银杏叶、山楂、蜂胶、葛根、银杏叶、山楂、蜂胶、葛根、沙棘、红花、荷叶、甘草、桑叶、沙棘、红花、荷叶、甘草、桑叶、陈皮、花粉、桑葚、陈皮、花粉、桑葚、黄芪、淫羊藿、鱼腥草黄芪、淫羊藿、鱼腥草YOUR SITE HEREYOUR SITE H

31、EREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO3.3.3.3.黄酮类黄酮类化合物的化合物的检测检测方法方法黄酮类黄酮类一、总黄酮的分光光度测定法、总黄酮的分光光度测定法 测定原理测定原理 -黄酮类化合物是具有苯骈吡喃环结构的一类天然化合物的黄酮类化合物是具有苯骈吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有总称，一般都具有4 4位羰基，且呈黄色。黄酮类化合物多分位羰基，且呈黄色。黄酮类化合物多分布于植物中，大多数以苷的形式存在。黄酮类化合物中的布于植物中，大多数以苷的形式存在。黄酮类化合物中的3-3-羟基、羟基、4-4-羟基或羟基或5-5-羟基或邻

32、二位酚羟基与铝盐进行络合羟基或邻二位酚羟基与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。反应，在碱性条件下生成红色的络合物。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO3.3.3.3.黄酮类黄酮类化合物的化合物的检测检测方法方法黄酮类黄酮类一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 样品处理样品处理1 1）固体样品：称取）固体样品：称取12g12g干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于平底烧瓶中加入平底烧瓶中加入50100mL70%50100

33、mL70%乙醇溶液，浸润后，在乙醇溶液，浸润后，在8080水水浴下回流浴下回流2h2h，至黄酮类化合物基本提取完全。粗提取液冷，至黄酮类化合物基本提取完全。粗提取液冷却后，减压抽滤，并用少量却后，减压抽滤，并用少量70%70%乙醇溶液洗涤残渣，合并滤乙醇溶液洗涤残渣，合并滤液。在液。在5050下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至烧瓶内溶下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至烧瓶内溶液呈无醇味。倒数烧瓶内溶液，并用液呈无醇味。倒数烧瓶内溶液，并用30mL30mL热水分热水分3 3次洗涤烧次洗涤烧瓶，抽滤后，将滤液导入分液漏斗中，以瓶，抽滤后，将滤液导入分液漏斗中，以75mL75mL氯仿分氯仿分3 3次萃次

34、萃取脱脂，待完全分层后，收集下层水溶液并定容至取脱脂，待完全分层后，收集下层水溶液并定容至50mL50mL。一、总黄酮的分光光度测定法、总黄酮的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO3.3.3.3.黄酮类黄酮类化合物的化合物的检测检测方法方法黄酮类黄酮类一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 样品处理样品处理 称取称取12g12g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱脂后的水溶液水饱和。吸取上

35、述脱脂后的水溶液12mL12mL，沿层析柱慢慢滴，沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用入柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用70%70%乙醇乙醇或甲醇洗脱，流速为或甲醇洗脱，流速为1.0mL/min,1.0mL/min,至流出液基本无色，一般至流出液基本无色，一般收集收集10mL10mL即可。上述洗出液用洗脱剂（即可。上述洗出液用洗脱剂（70%70%乙醇或甲醇）定乙醇或甲醇）定容后即可用于测定。容后即可用于测定。一、总黄酮的分光光度测定法、总黄酮的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE H

36、ERELOGOLOGOLOGOLOGO3.3.3.3.黄酮类黄酮类化合物的化合物的检测检测方法方法黄酮类黄酮类一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 样品处理样品处理2 2）液体样品：准确吸取样品）液体样品：准确吸取样品3.0mL3.0mL，定容至，定容至50mL50mL后，直接以后，直接以75mL75mL氯仿分氯仿分3 3次萃取脱脂，其余步骤同上。次萃取脱脂，其余步骤同上。一、总黄酮的分光光度测定法、总黄酮的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO

37、3.3.3.3.黄酮类黄酮类化合物的化合物的检测检测方法方法黄酮类黄酮类一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法 样品测定样品测定 准确吸取定量样品溶液，加入准确吸取定量样品溶液，加入30%30%乙醇液至乙醇液至5mL,5mL,各加各加5%5%亚硝亚硝酸钠溶液酸钠溶液0.3mL0.3mL，振摇后放置，振摇后放置5min5min，加入，加入10%10%硝酸铝溶液硝酸铝溶液0.3mL,0.3mL,摇匀后放置摇匀后放置60min60min，加，加1.0mol/L1.0mol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液2mL,2mL,用用30%30%乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用乙醇

38、定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用1cm1cm的比色的比色皿，在皿，在510nm510nm处测定吸光度。处测定吸光度。一、总黄酮的分光光度测定法、总黄酮的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO3.3.3.3.黄酮类黄酮类化合物的化合物的检测检测方法方法黄酮类黄酮类二、葡聚糖的分光光度测定法二、葡聚糖的分光光度测定法 注意事项注意事项方法精密度：对同一样品在相同条件下，重复测定6次，其相对标准差为4.4%。方法回收率：对总黄酮含量为1.52%的减肥茶加入相似浓度的芦丁标准品进行

39、回收试验，其平均回收率为103.2%。对于以葡萄、山楂等有色水果味原料的样品，可用未加铝盐试剂的样液为空白或采用标准加入法进行测定，以避免样液颜色对测定干扰而引起结果偏高。一、粗多糖的苯酚、粗多糖的苯酚硫酸分光光度测定法硫酸分光光度测定法一、总黄酮的分光光度测定法、总黄酮的分光光度测定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO3.3.3.3.黄酮类黄酮类化合物的化合物的检测检测方法方法原花青素原花青素二、原花青素的分光光度测定法二、原花青素的分光光度测定法 测定原理测定原理 -原花青素（也称

40、缩合单宁）是黄烷原花青素（也称缩合单宁）是黄烷3 3醇的寡聚体与多聚醇的寡聚体与多聚体，属多份类化合物。与其他酚类化合物不同，黄烷醇体，属多份类化合物。与其他酚类化合物不同，黄烷醇（缩合单宁、单体、双体等）在酸性介质中可与香草醛反（缩合单宁、单体、双体等）在酸性介质中可与香草醛反应，生成在应，生成在500nm500nm处有最大吸收的有色物质，可通过比色测处有最大吸收的有色物质，可通过比色测其含量。其含量。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO 样品处理样品处理1 1、植物材料经、植物材料经

41、4 4倍体积丙酮倍体积丙酮+水（水（7+37+3，体积比）或者经，体积比）或者经60%60%甲醇提取，甲醇提取，4040以下减压蒸馏去除有机溶剂，水相再经乙以下减压蒸馏去除有机溶剂，水相再经乙醚洗涤后沉淀。醚洗涤后沉淀。2 2、冰冻干燥的固体原青花素制剂，直接溶于水中（先加少、冰冻干燥的固体原青花素制剂，直接溶于水中（先加少量甲醇助溶），制成原青花素液。原青花素液与量甲醇助溶），制成原青花素液。原青花素液与5 5下暗下暗环境中保存备用。环境中保存备用。3.3.3.3.黄酮类化合物的检测方法黄酮类化合物的检测方法原花青素原花青素二、原花青素的分光光度测定法二、原花青素的分光光度测定法 YOUR

42、SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO 样品测定样品测定1 1 1 1、用锡箔将试管（、用锡箔将试管（14mm14mm14mm14mm*120mm120mm120mm120mm）包裹严，仅留试管）包裹严，仅留试管口用于加样。向管内加入试样口用于加样。向管内加入试样0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL，再加，再加3.0mL4%3.0mL4%3.0mL4%3.0mL4%香草醛甲醇液混合，然后加入香草醛甲醇液混合，然后加入1,5mL1,5mL1,5mL1,5mL浓盐酸，彻底混浓盐酸，彻底混匀，室温下显

43、色匀，室温下显色15min15min15min15min，也可在暗环境下进行以上操作。，也可在暗环境下进行以上操作。最后在最后在500nm500nm500nm500nm处比色。处比色。2 2 2 2、（、（0.1mg0.1mg0.1mg0.1mg原花青素在原花青素在500nm500nm500nm500nm处的吸收值为处的吸收值为0,550,550,550,55）3.3.3.3.黄酮类化合物的检测方法黄酮类化合物的检测方法原花青素原花青素二、原花青素的分光光度测定法二、原花青素的分光光度测定法 YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE

44、 HERELOGOLOGOLOGOLOGO 注意事项注意事项（1）本方法的检测范围为（5500）*10-3mg/0.5mL样液。精密度与准确度大于1*10-3mg。（2）反应试管应用清洁剂浸泡24小时，彻底洗涤干净。（3）进行比色时，用水作空白对照。（4）500nm处的OD值应控制在3以下。（5）试样中花青素含量较高时，应从香草醛存在下所测A500nm值中减去无香草醛时所测值。（6）显色液应避光放置。3.3.3.3.黄酮类化合物的检测方法黄酮类化合物的检测方法原花青素原花青素二、原花青素的分光光度测定法二、原花青素的分光光度测定法 YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOU

45、R SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO 测定原理测定原理 原花青素氧化后能生成红色的花青素。通常用铁盐催化比色法测定总量，利用硫酸高铁铵的催化作用，以盐（OD550）,与原花青素化学对照品比较，便可定量计算出样品中原花青素的含量。3.3.3.3.黄酮类化合物的检测方法黄酮类化合物的检测方法原花青素原花青素三、原花青素的铁盐催化比色测定法三、原花青素的铁盐催化比色测定法 YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO 样品处理样品处理 准确称取胶囊内容物0

46、.51.0g，加污水乙醇（遇醇溶性较差的样品，可加入少量的蒸馏水促进溶解），溶解（对于软胶囊取整粒称重后再用小刀割破，用超声波以乙醇多次提取）,定容至100mL,摇匀，即得到样品储备液。再移取0.51mL储备液（根据提取物浓度高低确定具体的量，使待测液原花青素浓度在0.050.20mg/mL范围内）定容至50mL,摇匀得到待测样品液。3.3.3.3.黄酮类化合物的检测方法黄酮类化合物的检测方法原花青素原花青素三、原花青素的铁盐催化比色测定法三、原花青素的铁盐催化比色测定法 YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOL

47、OGOLOGOLOGO 样品测定样品测定 移取1.00mL待测液依照上述标准曲线绘制同样操作，测定OD550，查标准曲线，并计算原花青素的含量。3.3.3.3.黄酮类化合物的检测方法黄酮类化合物的检测方法原花青素原花青素三、原花青素的铁盐催化比色测定法三、原花青素的铁盐催化比色测定法 YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO注意事项注意事项1、线性范围：本法原花青素浓度在26.00416.0g范围内，最低检出限为4g。2、准确性：添加浓度为52.00208.0g的标准（OD550在0.157

48、0.520范围内），3次测定平均回收率在90.64%109.5%。3、精密度（重现性）：同一样品液8次测定，相对标准差为2.13%2.98%。4、干扰物质：常见的维生素，芦丁、类胡萝卜素、食品抗氧化剂、各类油脂基体未见明显干扰，由于多糖、蛋白质不溶于无水乙醇，故不会干扰测定。3.3.3.3.黄酮类化合物的检测方法黄酮类化合物的检测方法原花青素原花青素三、原花青素的铁盐催化比色测定法三、原花青素的铁盐催化比色测定法 YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO4 4 4 4.酶、激素及酶、激素及内

49、内源性物源性物质质的的检测检测方法方法酶、激素酶、激素一、氯化高铁血红素的分光光度定法、氯化高铁血红素的分光光度定法 测定原理测定原理 氯化高铁血红素是以新鲜猪血经冰醋酸法提取加工而成的动物性补铁剂，能被人体黏膜上皮细胞分解为原卟啉及二价铁，从而进入血液被机体吸收和利用。氯化高铁血红素制品以氢氧化钠溶液溶解和定容后，以1cm比色皿于波长385nm处进行检测，与标准品比较进行定量。YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO 样品处理样品处理1）固体样品（胶囊或片剂）：准确称取一定量样品，一边研磨

50、，一边加入0.1mol/L氢氧化钠，使氯化高铁血红素充分溶解（注意不能加热溶解，否则引起结果偏高），定容后备检测。2）液体样品：摇匀后准确吸取一定量样品，用0.1mol/L氢氧化钠稀释后待测定。4.4.4.4.酶、激素及内源性物质的检测方法酶、激素及内源性物质的检测方法酶、激素酶、激素一、氯化高铁血红素的分光光度定法、氯化高铁血红素的分光光度定法YOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HEREYOUR SITE HERELOGOLOGOLOGOLOGO 标准曲线绘制标准曲线绘制 1、准确称取经105干燥至恒重的氯化高铁血红素标准品10.00mg，用0.1mo