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1、关于实验生物显微制片技术现在学习的是第1页，共25页实验目的与要求1.理解石蜡切片法各主要步骤的基本原理。理解石蜡切片法各主要步骤的基本原理。2.掌握各种试剂的配制和各种器材的使用方法。掌握各种试剂的配制和各种器材的使用方法。3.掌握石蜡切片法的具体操作方法。掌握石蜡切片法的具体操作方法。4.熟悉实验过程中应注意的事项。熟悉实验过程中应注意的事项。5.自己取材，植物、动物材料制备标本片。自己取材，植物、动物材料制备标本片。6.通过在显微镜下观察鱼肝细胞染色玻片标本，通过在显微镜下观察鱼肝细胞染色玻片标本，了解鱼肝细胞的显微结构。了解鱼肝细胞的显微结构。现在学习的是第2页，共25页生物制片技术概
2、述生物制片技术概述生物显微制片技术是观察研究细胞、组织、生物显微制片技术是观察研究细胞、组织、胚胎、动物等的形态、结构及病理变化的重胚胎、动物等的形态、结构及病理变化的重要方法。由于生活时的生物体器官组织过大要方法。由于生活时的生物体器官组织过大或过厚不能在光学显微镜下观察，或者能放或过厚不能在光学显微镜下观察，或者能放在光学显微镜下，光线也不能透过，而且一在光学显微镜下，光线也不能透过，而且一些微细结构的折光率相同，即使光线能够透些微细结构的折光率相同，即使光线能够透过也看不清楚。因此，就必须运用显微技术过也看不清楚。因此，就必须运用显微技术中各种方法将其制成玻片标本，使组织细胞中各种方法将
3、其制成玻片标本，使组织细胞既能在光学显微镜下观察又可长期保存，结既能在光学显微镜下观察又可长期保存，结构对比变明显。一般可分为切片法和非切片构对比变明显。一般可分为切片法和非切片法两类制片方法。法两类制片方法。现在学习的是第3页，共25页切片法：石蜡切片法；火棉胶切片法；冰冻切片法：石蜡切片法；火棉胶切片法；冰冻切片法等。切片法等。非切片法：包括整体封藏法；涂布法；压非切片法：包括整体封藏法；涂布法；压片法，此外还有片法，此外还有铺片、磨片铺片、磨片等。等。显微制片需经历一系列操作，相当细致而复显微制片需经历一系列操作，相当细致而复杂，每一步骤的失误都可导致整体的失败，杂，每一步骤的失误都可导
4、致整体的失败，因此需要耐心细致，手脑并用。因此需要耐心细致，手脑并用。切片法：取材切片法：取材固定固定冲洗冲洗脱水脱水透明透明包包埋埋切片切片染色染色脱水脱水透明透明封藏。封藏。非切片法：取材非切片法：取材固定固定冲洗冲洗脱水脱水透明透明染色染色脱水脱水 透明透明封藏封藏现在学习的是第4页，共25页切片法与非切片法比较切片法与非切片法比较切片法能显示出组织、细胞内部的微细结构切片法能显示出组织、细胞内部的微细结构,且对比非常明显且对比非常明显清晰。但操作步骤多清晰。但操作步骤多,手续复杂手续复杂,制片速度慢制片速度慢,耗时较长。耗时较长。如洋葱根尖纵切片中对线粒体、有丝分裂的观察如洋葱根尖纵切
5、片中对线粒体、有丝分裂的观察;小麦叶片横切和玉小麦叶片横切和玉米叶横切中对细胞木质化细胞质、纤维素细胞质的观察。切片法米叶横切中对细胞木质化细胞质、纤维素细胞质的观察。切片法是生物显微制片技术中最常用和最主要的方法是生物显微制片技术中最常用和最主要的方法,其中又以石蜡切其中又以石蜡切片法最为重要。片法最为重要。非切片法能保持生物体或某部分器官组织的原有状态及其完整性非切片法能保持生物体或某部分器官组织的原有状态及其完整性,但但因不经过切片手续因不经过切片手续,不仅不能清晰地显示各器官组织之间的相互关不仅不能清晰地显示各器官组织之间的相互关系系,更无法显示组织和细胞之间的结构关系。更无法显示组织
6、和细胞之间的结构关系。非切片法中整体切片法仅能对很小的材料制片非切片法中整体切片法仅能对很小的材料制片,如人体口腔上皮如人体口腔上皮装片装片,草履虫装片。涂片法仅对含有大量水分或完全为液体的组织或草履虫装片。涂片法仅对含有大量水分或完全为液体的组织或器官适用。器官适用。现在学习的是第5页，共25页1 非切片法非切片法1.1 1.1 涂片法涂片法 主要用于血液、精液、尿液、微生物液体培养物等不主要用于血液、精液、尿液、微生物液体培养物等不能用切片法制成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂能用切片法制成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，还可再经固定，脱水，染色等手段制成永久成单层细胞
7、，还可再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。标本。1.2 1.2 铺片法铺片法 主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。迅速平铺在载玻片上。如如:洋葱表皮细胞的铺片制洋葱表皮细胞的铺片制备。备。现在学习的是第6页，共25页1.3 1.3 压片法压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使
8、组织散成一薄片，再进行观察，指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖压片观察染色体。如植物根尖压片观察染色体。1.4 1.4 磨片磨片 用于质地坚硬的组织，如骨和牙。用于质地坚硬的组织，如骨和牙。1.5 1.5 离析法离析法 此法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使组织分此法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使组织分散成单个游离细胞。如植物去壁低渗法制备染色体标本。散成单个游离细胞。如植物去壁低渗法制备染色体标本。现在学习的是第7页，共25页2 2 切片法切片法切切片片是是供供光光学学显显微微镜镜或或电电子子显显微微镜镜观观察察的的动植物组织薄片。动植物组织薄片。切切片片法
9、法是是通通过过手手工工或或切切片片机机将将组组织织切切成成薄薄片片来来进进行行观观察察的的方方法法。需需先先经经过过一一系系列列步步骤骤将将组组织织内内渗渗入入某某些些支支持持物物质质，使使组组织织变变硬硬以以利利于于切切成成薄薄片片，根根据据所所用用支支持持剂剂的的种种类类不不同同，可可分分为为徒徒手手切切片片法法，石石蜡蜡切切片片法法，火火棉棉胶胶切切法法，冰冰冻冻切切片片法法等等类类型型，切切成成薄薄片片后后还还需需要要去蜡，染色，脱水，透明等步骤。去蜡，染色，脱水，透明等步骤。现在学习的是第8页，共25页2.1 2.1 石蜡切片法石蜡切片法石蜡切片法包括以下各主要步骤：取材固定洗涤和脱
10、水透明浸蜡包埋切片与粘片脱蜡染色脱水透明封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，标本片可以长期保存使用。现在学习的是第9页，共25页详细步骤和各个环节要求详细步骤和各个环节要求取材：材料必须取材：材料必须新鲜、完整新鲜、完整，搁置时间过久则产生蛋，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，且白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，且避避免挤压、挫伤免挤压、挫伤而不能反映组织活体时的形态结构。而不能反映组织活体时的形态结构。注明注明采集时间、地点、名称、组织部位等。组织块大小采集时间、地点、名称、组织部位等。组织块大小以以0.50.50.50.50.2cm0
11、.2cm为宜。为宜。固定：用化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速固定：用化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构保持其活体时的结构。此外固定还有使组织。此外固定还有使组织硬化作用，硬化作用，助染作用助染作用。此外还有物理方法如。此外还有物理方法如干燥、高热和低温骤冷干燥、高热和低温骤冷等方法固定。等方法固定。现在学习的是第10页，共25页洗涤与脱水：洗涤与脱水：洗涤：固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液
12、洗涤：固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多以流水冲洗。及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多以流水冲洗。脱水：洗涤后的组织内充满水分，需除去水分方可脱水：洗涤后的组织内充满水分，需除去水分方可进行之后的透明、浸蜡与包埋。脱水用一种既能与水又进行之后的透明、浸蜡与包埋。脱水用一种既能与水又能与透明剂混溶的液体来逐渐置换样品中游离的水。脱能与透明剂混溶的液体来逐渐置换样品中游离的水。脱水剂常采用乙醇或丙酮、水剂常采用乙醇或丙酮、正丁醇、叔丁醇正丁醇、叔丁醇进行梯度脱水。进行梯度脱水。每次时间为每次时间为1 1数小时。数小时。脱水的过程：通常从脱水的过程
13、：通常从3030或或5050乙醇开始，一般是乙醇开始，一般是30%30%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇80%90%100%100%80%90%100%100%脱水剂浓度不应跨度太大，以免引起组织强烈的收缩或脱水剂浓度不应跨度太大，以免引起组织强烈的收缩或变形。变形。现在学习的是第11页，共25页 透明透明 透明是用一种既能与脱水剂（乙醇）又能与包埋介质透明是用一种既能与脱水剂（乙醇）又能与包埋介质（石蜡）互溶的液体来置换样品中的脱水剂（乙醇），从而（石蜡）互溶的液体来置换样品中的脱水剂（乙醇），从而为最终的包埋创造一个有利的条件。为最终的包埋创造一个有利的条件。现采用的透明剂
14、一般现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿、香柏油等。是二甲苯，甲苯，氯仿、香柏油等。一般过程为：一般过程为：1/31/3二甲苯二甲苯+2/3+2/3乙醇混合液乙醇混合液1/21/2二甲二甲苯苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液2/32/3二甲苯二甲苯+1/3+1/3乙醇混合液乙醇混合液二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，渗透力强，二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，渗透力强，溶蜡量大，易挥发，缺点是易使组织收缩，变硬，变溶蜡量大，易挥发，缺点是易使组织收缩，变硬，变脆。脆。现在学习的是第12页，共25页浸蜡浸蜡 将将完完成成透透明明步步骤骤的的组组织织块块浸浸入入透透明明
15、剂剂与与石石蜡蜡混混合合液液中中，梯梯度度提提高高石石蜡蜡的的比比例例，直直至至用用石石蜡蜡完完全全置置换换组组织织块块中的透明剂，便于之后的包理与切片。中的透明剂，便于之后的包理与切片。浸浸蜡蜡要要在在温温箱箱（6060，液液态态石石蜡蜡）中中进进行行，每每级级1-1-3h3h。包埋包埋 样样品品浸浸蜡蜡后后，内内部部间间隙隙已已完完全全被被石石蜡蜡占占据据，接接着着还还需需要要用用同同种种硬硬度度的的石石蜡蜡包包埋埋成成蜡蜡块块以以便便切切片片。用用镊镊子子轻轻轻轻将将浸浸蜡蜡后后的的组组织织块块夹夹入入盛盛有有液液态态石石蜡蜡的的纸纸盒盒，摆摆好好位位置置，待待石蜡冷却成固态即包埋完毕。
16、可同时包埋多块组织。石蜡冷却成固态即包埋完毕。可同时包埋多块组织。至此，组织材料的前处理过程已完成，可用于切片。至此，组织材料的前处理过程已完成，可用于切片。现在学习的是第13页，共25页切片切片修块：切片前需修整蜡块，先将大块蜡块切开，使每一小块修块：切片前需修整蜡块，先将大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，再修整成正方体或长方体，从切面看都含有一块组织，再修整成正方体或长方体，从切面看组织周围的石蜡厚度相等组织周围的石蜡厚度相等(3mm)(3mm)。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台（台木）上，以便固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台（台木）上，以便于固定在切片机上。于固定在切片
17、机上。切片：调整切片机刀片位置与台木上的蜡面平行切片：调整切片机刀片位置与台木上的蜡面平行。一手持。一手持毛笔，一手转动切片机，切下的蜡片连成一长条蜡带。毛笔，一手转动切片机，切下的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带根据需要切成数段，放在切下的蜡带根据需要切成数段，放在4040水面上。水面上。贴片：蜡带分别用粘片剂（蛋白甘油）贴在干净载玻片贴片：蜡带分别用粘片剂（蛋白甘油）贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。上。在恒温展片台上展平，烘干。现在学习的是第14页，共25页现在学习的是第15页，共25页脱蜡、水化、染色脱蜡、水化、染色蜡蜡带带必必须须先先用用二二甲甲苯苯去去除除石石蜡蜡再再用用乙
18、乙醇醇去去除除二甲苯，再进入水中，才能染色。二甲苯，再进入水中，才能染色。染染色色的的方方法法很很多多，要要根根据据标标本本要要求求显显示示的的目目的的选选择择不不同同的的染染剂剂，最最常常用用的的是是苏苏木木精精-伊伊红红染染色色（HE HE 染染色色）。苏苏木木精精使使细细胞胞核核显显深深紫紫色色，伊伊红红使使细细胞胞质质显显粉粉红红色色，可可显示清晰的细胞形态和核的大小，位置。显示清晰的细胞形态和核的大小，位置。染染色色后后再再使使带带水水的的切切片片经经历历脱脱水水透透明明，最最后用树胶封片。后用树胶封片。现在学习的是第16页，共25页HEHE染色：苏木精（染色：苏木精（Hematox
19、ylinHematoxylin）伊红（）伊红（EosinEosin）染色）染色碱性染料碱性染料将嗜碱性物质（本将嗜碱性物质（本身酸性）染成蓝色身酸性）染成蓝色酸性染料酸性染料将嗜酸性物质（本将嗜酸性物质（本身碱性）染成红色身碱性）染成红色细胞核中的细胞核中的DNADNA、RNARNA细细胞质中的胞质中的RNARNA细胞质、膜性结构细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、（线粒体、溶酶体、滑面内质网）滑面内质网）现在学习的是第17页，共25页 (l)(l)细胞核染色剂细胞核染色剂 用用于于细细胞胞核核的的染染色色剂剂有有天天然然染染色色剂剂的的苏苏木木精精、洋洋红红以以及及合合成成染染色色剂剂中中的的
20、番番红红、结结品品紫紫、硫硫堇堇、甲甲苯苯胺胺蓝蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。(2)(2)细胞质染色剂细胞质染色剂 用用于于细细胞胞质质的的染染色色剂剂有有合合成成染染色色剂剂中中的的曙曙红红、亮亮绿、橘黄绿、橘黄G G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。（3 3）脂质染色剂）脂质染色剂 用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹IIIIII、苏丹苏丹IvIv、硫酸尼罗蓝及油红等。、硫酸尼罗蓝及油红等。现在学习的是第18页，共25页其步骤如下：其步骤如下：二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯1/
21、21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混乙醇混合液合液100%100%乙醇乙醇95%95%乙醇乙醇85%85%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇30%30%乙醇乙醇苏木精染液苏木精染液0.01%0.01%盐酸盐酸0.01%0.01%氢氧化钠氢氧化钠蒸馏水蒸馏水30%30%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇85%85%乙醇乙醇伊红染液伊红染液95%95%乙醇乙醇100%100%乙醇乙醇100%100%乙醇乙醇1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液二甲苯二甲苯二二甲苯甲苯封片封片现在学习的是第19页，共25页镜检、贴标签、干燥、记录。镜检、贴标签
22、、干燥、记录。现在学习的是第20页，共25页3 石蜡切片实例石蜡切片实例鱼肝制片鱼肝制片材料：鱼肝（厚材料：鱼肝（厚2-3mm，carnoy3-4h/bouin/Zenker固固定定24h）。）。试剂：固定液，埃里希苏木精染液，试剂：固定液，埃里希苏木精染液，1%伊红水溶液，伊红水溶液，1%盐酸乙醇溶液，氨水，二甲苯，盐酸乙醇溶液，氨水，二甲苯，30%100%各级乙醇，各级乙醇，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。甘油蛋白粘片剂，中性树胶。苏木精为碱性染料（含阳离子），伊红为酸性染料，鱼肝细胞核含酸性物质，苏木精为碱性染料（含阳离子），伊红为酸性染料，鱼肝细胞核含酸性物质，易与碱性染料的阳离子结合染上蓝
23、色，胞质含碱性物质，易与酸性染料中阴易与碱性染料的阳离子结合染上蓝色，胞质含碱性物质，易与酸性染料中阴离子结合而染上粉红色。离子结合而染上粉红色。现在学习的是第21页，共25页实验程序：实验程序：取材取材（2-355 mm3）固定固定（carnoy3-4h，bouin 12-24h）洗涤（洗涤（70%乙醇乙醇3-5次）次）脱水脱水（80%、90、100、100%乙乙醇各醇各0.5h）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯等量混合二甲苯等量混合15min，二甲苯，二甲苯15min 2次）次）透蜡透蜡（二甲苯（二甲苯+石蜡各半石蜡各半35-37,0.5h，石蜡，石蜡56-60,0.5h 2次）次）包埋包埋（
24、凝（凝30min）切片切片（8m，水面展开），水面展开）贴片贴片（涂粘片剂，滴水（涂粘片剂，滴水1滴）滴）展片展片（40-45）烘干烘干（37，24h）脱蜡脱蜡（二甲苯（二甲苯2-5min，二甲苯，二甲苯+乙醇乙醇2-5min）复水复水（100%、90、80、70、50%、蒸馏水各、蒸馏水各2min）染色染色（埃里希（埃里希苏木精染液苏木精染液15-20min）水洗水洗（2.5min 换换2次，共次，共5min）分色分色（分化，（分化，1%盐酸乙醇溶液数秒，再水洗盐酸乙醇溶液数秒，再水洗1min，染色合适可，染色合适可不做此步，）不做此步，）蓝化（氨水蓝化（氨水3-4s）水洗水洗（2次共次共5
25、min）复染复染色色（1%伊红水溶液伊红水溶液1-5min）脱水脱水（50%数秒、数秒、70%、80%、100、100%乙醇各乙醇各2min）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯二甲苯5min，二甲苯，二甲苯5min 2次）次）封藏封藏（中性树胶（中性树胶 50）。）。现在学习的是第22页，共25页4 植物组织制片技术实例植物组织制片技术实例4.1 徒手切片徒手切片重要的是切下一小片平而薄的组织，而不是切下完整的组织片；重要的是切下一小片平而薄的组织，而不是切下完整的组织片；左手持材料或夹持物（莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等），右左手持材料或夹持物（莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等），右手平稳持刀（刀片或手
26、术刀），用臂力不用腕力；手平稳持刀（刀片或手术刀），用臂力不用腕力；刀刃平置经削平的平面上，轻轻压住刀片，以均匀的力量平稳的动作，刀刃平置经削平的平面上，轻轻压住刀片，以均匀的力量平稳的动作，从刀刃的右侧斜向左侧切削，不可挤压材料或拉锯式切割；从刀刃的右侧斜向左侧切削，不可挤压材料或拉锯式切割；材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯；材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯；切片可简易染色切片可简易染色1-2min，0.1%亚甲基蓝，亚甲基蓝，0.5%中性红，中性红，1%番红番红（木质化细胞壁及核染成红色）（木质化细胞壁及核染成红色）I I2 2-KI-KI溶液（淀粉粒蓝色，核呈溶液（淀粉粒
27、蓝色，核呈黄色）黄色）现在学习的是第23页，共25页4.2 石蜡切片法（根、茎、叶）显微观察，便于器官的立体重构。显微观察，便于器官的立体重构。硬质材料可用滑走切片机，一般可用手摇切片机。硬质材料可用滑走切片机，一般可用手摇切片机。程序：程序：取材取材（0.5-1cm3）固定固定（卡诺、（卡诺、FAA，2-24h，材料有，材料有空气的需抽气）空气的需抽气）洗涤洗涤（70%乙醇乙醇2次）次）脱水脱水（80%、90、100、100%乙醇各乙醇各0.5h）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯等量混合二甲苯等量混合15min，二甲苯，二甲苯0.5h 2次）次）透蜡透蜡（二甲苯（二甲苯+石蜡各半石蜡各半35-37,0.5-48h，石蜡，石蜡56-60,0.5-1h 2次）次）包埋包埋（凝（凝30min）切片切片（8m，水面展开），水面展开）贴片贴片（涂粘片剂，滴水（涂粘片剂，滴水1滴）滴）展片展片（40-45）烘干烘干（37，24h）。）。现在学习的是第24页，共25页26.09.2022感谢大家观看现在学习的是第25页，共25页