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1、实验实验1111生物显微制片技生物显微制片技术术实验目的与要求1.理解石蜡切片法各主要步骤的基本原理。理解石蜡切片法各主要步骤的基本原理。2.掌握各种试剂的配制和各种器材的使用方掌握各种试剂的配制和各种器材的使用方法。法。3.掌握石蜡切片法的具体操作方法。掌握石蜡切片法的具体操作方法。4.熟悉实验过程中应注意的事项。熟悉实验过程中应注意的事项。5.自己取材，植物、动物材料制备标本片。自己取材，植物、动物材料制备标本片。6.通过在显微镜下观察鱼肝细胞染色玻片标通过在显微镜下观察鱼肝细胞染色玻片标本，了解鱼肝细胞的显微结构。本，了解鱼肝细胞的显微结构。2.1 2.1 石蜡切片法石蜡切片法石蜡切片法
2、包括以下各主要步骤：取材固定洗涤和脱水透明浸蜡包埋切片与粘片脱蜡染色脱水透明封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，标本片可以长期保存使用。详细步骤和各个环节要求详细步骤和各个环节要求取材：材料必须取材：材料必须新鲜、完整新鲜、完整，搁置时间过久则产，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，且且避免挤压、挫伤避免挤压、挫伤而不能反映组织活体时的形态而不能反映组织活体时的形态结构。结构。注明采集时间、地点、名称、组织部位等。注明采集时间、地点、名称、组织部位等。组织块大小以组织块大小以0.50.50.50.50.
3、2cm0.2cm为宜。为宜。固定：用化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，迅固定：用化学药液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能尽可能保持其活体时的结构保持其活体时的结构。此外固定还有使组。此外固定还有使组织织硬化作用，硬化作用，助染作用助染作用。此外还有物理方法如。此外还有物理方法如干干燥、高热和低温骤冷等方法固定。燥、高热和低温骤冷等方法固定。洗涤与脱水：洗涤与脱水：洗涤：固定后的组织材料需除去留在组织内的固洗涤：固定后的组织材料需除
4、去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多定液及其结晶沉淀，以免影响以后的染色效果。多以流水冲洗。以流水冲洗。脱水：洗涤后的组织内充满水分，需除去水分方脱水：洗涤后的组织内充满水分，需除去水分方可进行之后的透明、浸蜡与包埋。脱水用一种既能可进行之后的透明、浸蜡与包埋。脱水用一种既能与水又能与透明剂混溶的液体来逐渐置换样品中游与水又能与透明剂混溶的液体来逐渐置换样品中游离的水。脱水剂常采用乙醇或丙酮、离的水。脱水剂常采用乙醇或丙酮、正丁醇、叔丁正丁醇、叔丁醇醇进行梯度脱水。每次时间为进行梯度脱水。每次时间为1 1数小时。数小时。脱水的过程：通常从脱水的过程：通常从3030或或5
5、050乙醇开始，一般乙醇开始，一般是是30%30%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇80%90%100%100%80%90%100%100%脱水剂浓度不应跨度太大，以免引起组织强烈的脱水剂浓度不应跨度太大，以免引起组织强烈的收缩或变形。收缩或变形。透明透明 透明是用一种既能与脱水剂（乙醇）又能与包埋透明是用一种既能与脱水剂（乙醇）又能与包埋介质（石蜡）互溶的液体来置换样品中的脱水剂介质（石蜡）互溶的液体来置换样品中的脱水剂（乙醇），从而为最终的包埋创造一个有利的条件。（乙醇），从而为最终的包埋创造一个有利的条件。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿、香柏现采用的透明剂一般是二甲
6、苯，甲苯，氯仿、香柏油等。油等。一般过程为：一般过程为：1/31/3二甲苯二甲苯+2/3+2/3乙醇混合液乙醇混合液1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液2/32/3二甲苯二甲苯+1/3+1/3乙醇混合液乙醇混合液二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，渗透力强，二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，渗透力强，溶蜡量大，易挥发，缺点是易使组织收缩，变硬，溶蜡量大，易挥发，缺点是易使组织收缩，变硬，变脆。变脆。浸蜡浸蜡 将将完完成成透透明明步步骤骤的的组组织织块块浸浸入入透透明明剂剂与与石石蜡蜡混混合合液液中中，梯梯度度提提高高石石蜡蜡的的比比例例，直直至至用用
7、石石蜡蜡完完全全置置换组织块中的透明剂，便于之后的包理与切片。换组织块中的透明剂，便于之后的包理与切片。浸浸蜡蜡要要在在温温箱箱（6060，液液态态石石蜡蜡）中中进进行行，每每级级1-3h1-3h。包埋包埋 样样品品浸浸蜡蜡后后，内内部部间间隙隙已已完完全全被被石石蜡蜡占占据据，接接着着还还需需要要用用同同种种硬硬度度的的石石蜡蜡包包埋埋成成蜡蜡块块以以便便切切片片。用用镊镊子子轻轻轻轻将将浸浸蜡蜡后后的的组组织织块块夹夹入入盛盛有有液液态态石石蜡蜡的的纸纸盒盒，摆摆好好位位置置，待待石石蜡蜡冷冷却却成成固固态态即即包包埋埋完完毕毕。可同时包埋多块组织。可同时包埋多块组织。至至此此，组组织织材
8、材料料的的前前处处理理过过程程已已完完成成，可可用用于于切切片。片。切片切片修块：切片前需修整蜡块，先将大块蜡块切开，使每修块：切片前需修整蜡块，先将大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，再修整成正方体或长方体，一小块都含有一块组织，再修整成正方体或长方体，从切面看组织周围的石蜡厚度相等从切面看组织周围的石蜡厚度相等(3mm)(3mm)。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台（台木）固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台（台木）上，以便于固定在切片机上。上，以便于固定在切片机上。切片：调整切片机刀片位置与台木上的蜡面平行切片：调整切片机刀片位置与台木上的蜡面平行。一。一手持毛笔，一手转动切片
9、机，切下的蜡片连成一长手持毛笔，一手转动切片机，切下的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带根据需要切成数段，放在条蜡带。切下的蜡带根据需要切成数段，放在4040水面上。水面上。贴片：蜡带分别用粘片剂（蛋白甘油）贴在干净载玻贴片：蜡带分别用粘片剂（蛋白甘油）贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。片上。在恒温展片台上展平，烘干。脱蜡、水化、染色脱蜡、水化、染色蜡蜡带带必必须须先先用用二二甲甲苯苯去去除除石石蜡蜡再再用用乙乙醇醇去去除除二甲苯，再进入水中，才能染色。二甲苯，再进入水中，才能染色。染染色色的的方方法法很很多多，要要根根据据标标本本要要求求显显示示的的目目的的选选择择不不同同的的染染剂剂
10、，最最常常用用的的是是苏苏木木精精-伊伊红红染染色色（HE HE 染染色色）。苏苏木木精精使使细细胞胞核核显显深深紫紫色色，伊伊红红使使细细胞胞质质显显粉粉红红色色，可可显示清晰的细胞形态和核的大小，位置。显示清晰的细胞形态和核的大小，位置。染染色色后后再再使使带带水水的的切切片片经经历历脱脱水水透透明明，最最后用树胶封片。后用树胶封片。HEHE染色：苏木精（染色：苏木精（HematoxylinHematoxylin）伊红（）伊红（EosinEosin）染色）染色碱性染料碱性染料将嗜碱性物质（本将嗜碱性物质（本身酸性）染成蓝色身酸性）染成蓝色酸性染料酸性染料将嗜酸性物质（本将嗜酸性物质（本身碱
11、性）染成红色身碱性）染成红色细胞核中的细胞核中的DNADNA、RNARNA细细胞质中的胞质中的RNARNA细胞质、膜性结构细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、（线粒体、溶酶体、滑面内质网）滑面内质网）(l)(l)细胞核染色剂细胞核染色剂 用用于于细细胞胞核核的的染染色色剂剂有有天天然然染染色色剂剂的的苏苏木木精精、洋洋红红以以及及合合成成染染色色剂剂中中的的番番红红、结结品品紫紫、硫硫堇堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。(2)(2)细胞质染色剂细胞质染色剂 用用于于细细胞胞质质的的染染色色剂剂有有合合成成染染色色剂剂中中的的曙曙红红、亮亮绿绿
12、、橘橘黄黄G G、酸酸性性品品红红、苦苦味味酸酸和和水水溶溶性性苯苯胺胺蓝蓝等。等。（3 3）脂质染色剂）脂质染色剂 用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹IIIIII、苏丹、苏丹IvIv、硫酸尼罗蓝及油红等。、硫酸尼罗蓝及油红等。其步骤如下：其步骤如下：二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混乙醇混合液合液100%100%乙醇乙醇95%95%乙醇乙醇85%85%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇30%30%乙醇乙醇苏木精染液苏木精染液0.01%0.01%盐酸盐酸0.01%0.01%氢氧化钠氢氧化钠蒸馏水蒸馏
13、水30%30%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇85%85%乙醇乙醇伊红染液伊红染液95%95%乙醇乙醇100%100%乙醇乙醇100%100%乙乙醇醇1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯封片封片镜检、贴标签、干燥、记录。镜检、贴标签、干燥、记录。3石蜡切片实例石蜡切片实例鱼肝制片鱼肝制片材料：鱼肝（厚材料：鱼肝（厚2-3mm，carnoy3-4h/bouin/Zenker固定固定24h）。）。试剂：固定液，埃里希苏木精染液，试剂：固定液，埃里希苏木精染液，1%伊红水溶液，伊红水溶液，1%盐酸乙醇溶液，氨水，二甲苯，盐酸乙醇溶液，氨
14、水，二甲苯，30%100%各各级乙醇，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。级乙醇，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。苏木精为碱性染料（含阳离子），伊红为酸性染料，鱼肝细胞核含酸性苏木精为碱性染料（含阳离子），伊红为酸性染料，鱼肝细胞核含酸性物质，易与碱性染料的阳离子结合染上蓝色，胞质含碱性物质，易与酸物质，易与碱性染料的阳离子结合染上蓝色，胞质含碱性物质，易与酸性染料中阴离子结合而染上粉红色。性染料中阴离子结合而染上粉红色。实验程序：实验程序：取材取材（2-355mm3）固定固定（carnoy3-4h，bouin12-24h）洗洗涤涤（70%乙醇乙醇3-5次）次）脱水脱水（80%、90、100、100%乙醇各乙
15、醇各0.5h）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯等量混合二甲苯等量混合15min，二甲苯，二甲苯15min2次）次）透蜡透蜡（二甲苯（二甲苯+石蜡各半石蜡各半35-37,0.5h，石蜡，石蜡56-60,0.5h2次）次）包埋包埋（凝（凝30min）切片切片（8m，水面展开），水面展开）贴贴片片（涂粘片（涂粘片剂剂，滴水，滴水1滴）滴）展片展片（40-45）烘干烘干（37，24h）脱蜡脱蜡（二甲苯（二甲苯2-5min，二甲苯，二甲苯+乙醇乙醇2-5min）复水复水（100%、90、80、70、50%、蒸、蒸馏馏水各水各2min）染色染色（埃里希苏木精染液埃里希苏木精染液15-20min）水洗水洗（2.
16、5min换换2次，次，共共5min）分色分色（分化，（分化，1%盐酸乙醇溶液数秒，再水洗盐酸乙醇溶液数秒，再水洗1min，染色合适可不做此步，），染色合适可不做此步，）蓝蓝化（氨水化（氨水3-4s）水水洗洗（2次共次共5min）复染色复染色（1%伊红水溶液伊红水溶液1-5min）脱水脱水（50%数秒、数秒、70%、80%、100、100%乙醇各乙醇各2min）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯二甲苯5min，二甲苯，二甲苯5min2次）次）封藏封藏（中性（中性树树胶胶50）。）。4植物组织制片技术实例植物组织制片技术实例4.1徒手切片徒手切片重要的是切下一小片平而薄的组织，而不是切下完整的组织重要的
17、是切下一小片平而薄的组织，而不是切下完整的组织片；片；左手持材料或夹持物（莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等），左手持材料或夹持物（莴苣茎、胡萝卜根、泡沫塑料等），右手平稳持刀（刀片或手术刀），用臂力不用腕力；右手平稳持刀（刀片或手术刀），用臂力不用腕力；刀刃平置经削平的平面上，轻轻压住刀片，以均匀的力量平刀刃平置经削平的平面上，轻轻压住刀片，以均匀的力量平稳的动作，从刀刃的右侧斜向左侧切削，不可挤压材料或稳的动作，从刀刃的右侧斜向左侧切削，不可挤压材料或拉锯式切割；拉锯式切割；材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯；材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯；切片可简易染色切片可简易染色1-2mi
18、n，0.1%亚甲基蓝，亚甲基蓝，0.5%中性红，中性红，1%番红（木质化细胞壁及核染成红色）番红（木质化细胞壁及核染成红色）I I2 2-KI-KI溶液（淀粉粒溶液（淀粉粒蓝色，核呈黄色）蓝色，核呈黄色）4.2 石蜡切片法（根、茎、叶）显微观察，便于器官的立体重构。显微观察，便于器官的立体重构。硬质材料可用滑走切片机，一般可用手摇切片机。硬质材料可用滑走切片机，一般可用手摇切片机。程序：程序：取材取材（0.5-1cm3）固定固定（卡（卡诺诺、FAA，2-24h，材料有空气的需抽气）材料有空气的需抽气）洗洗涤涤（70%乙醇乙醇2次）次）脱水脱水（80%、90、100、100%乙醇各乙醇各0.5h
19、）透明透明（乙醇（乙醇+二甲苯等量混合二甲苯等量混合15min，二甲苯，二甲苯0.5h2次）次）透蜡透蜡（二甲（二甲苯苯+石蜡各半石蜡各半35-37,0.5-48h，石蜡，石蜡56-60,0.5-1h2次）次）包埋包埋（凝（凝30min）切片切片（8m，水面展开），水面展开）贴贴片片（涂粘片（涂粘片剂剂，滴水，滴水1滴）滴）展片展片（40-45）烘干烘干（37，24h）。）。脱蜡染色脱蜡染色植物材料植物材料干燥后，脱蜡染色：干燥后，脱蜡染色：100二甲苯（二甲苯（10min2次）次）（二甲苯纯乙醇（二甲苯纯乙醇1:1）（5min）100乙醇（乙醇（5min）95乙醇（乙醇（5min）85乙醇（
20、乙醇（5min）70%乙醇（乙醇（5min）50%乙醇乙醇（5min）30%乙醇（乙醇（5min）H2O(2min)1%番红水溶液番红水溶液(2h)H2O(几秒几秒)50%乙醇乙醇(10min)70%乙醇乙醇(10min)80%乙醇乙醇(10min)90%乙醇乙醇(10min)95%乙醇乙醇(10min）1%固绿（固绿（30s，95%乙醇配制）乙醇配制）95%乙醇（几秒）乙醇（几秒）100乙醇（乙醇（5min）（二甲苯无水乙醇（二甲苯无水乙醇1 1）（）（5min）100二二甲苯（甲苯（5min）100二甲苯（二甲苯（5min）封藏封藏（中性（中性树树胶胶50）。）。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！26