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1、植物显微制片技术植物显微制片技术石蜡切片法石蜡切片法石蜡切片法石蜡切片法 南京师范大学 生命科学学院在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前，必须根据植物材料的特性，采用不同的方法，对植物材料进行处理，把材料制成透明的玻片标本。根据材料的性质和制作法的不同，常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类，前者常用的有徒手切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡切片法、冷冻切片法等，其中以石蜡切片法最为常用。后者包括整体封藏法、涂布法、压片法等。石蜡切片法石蜡切片法 石蜡切片法是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经一系列处理制成永久制片的方法。在研究植物的细胞、组织、胚胎以及形态等方
2、面石蜡切片法是最理想的制片方法。石蜡切片法的一般流程为：取材固定抽气洗涤脱水透明浸蜡包埋修块切片粘片染色封片。取材 用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。取材的注意事项如下：（1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置对照材料。（2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径5mm，切取成5-10mm小段；叶片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。雌、雄蕊一般不需分割。（3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时，需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早
3、晨9：00-10：00时取材，此时植物细胞分裂活动较明显。（4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）；对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率较低。（二）固定（二）固定将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。良好的固定剂，应是穿
4、透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。常用固定液：常用固定液：简单固定液 以一种化学药品配制的固定液。乙醇 为凝固型固定剂。常用无水乙醇或95乙醇。甲醛 为非凝固性固定剂。具强烈刺激性气味。纯净的甲醛为无色透明液体。固定用的浓度为4%-10。醋酸 为凝固型固定剂。为无色透明的液体，刺激性极强，低温下凝结成冰，故又名冰醋酸。2.混合固定液：混合固定液：由几种试剂，适量配制而成。混合遵循原则：优缺点互补；膨胀与收缩相互平衡；强氧化剂与还原剂应分别配置。常用混合固定液有下列几种：常用混合固定液有下列几种：FAA 固定液（福尔马林冰醋酸乙醇）广泛适用于根、
5、茎、叶、花药、子房的组织切片，所以又称为万能固定液。一般固定时间不低于24 h。该固定液优点是在较低温度下（10左右）适用于材料的长期保存，可兼作保存液。并且固定的材料，不妨碍染色，但用于细胞学上的固定效果较差。纳瓦兴(Navaschjns)固定液 1912年首创。适用于细胞学与组织学研究的切片观察。但渗透慢，不能长期保存；主要用于显示分裂相。（三）抽气植物材料内部多由于含有空气，导致固定液不能完全深入。材料投入固定液后需要立即抽气。以便让固定液有效透入材料组织中，并排除材料内气泡的干扰。一般抽气时间为20-30 min。抽过气的材料在停止抽气，应沉入底部。（四）洗涤固定液中的成分有可能会妨碍
6、染色或发生沉淀或结晶，影响观察；有的还会继续作用，使材料变质等。因此，在使用材料时，需根据固定液的种类，用水、缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液。如：用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次。如用水洗涤，可将材料自固定液中取出，放入指形管，加入半管水，用纱布将管口扎紧，置于水槽内，进行流水冲洗。流水冲洗时间一般为12-24 h。（五）脱水材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分解。而且透明剂与水是不相混合的，不利于材料的透明和包埋等后期处理。因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能与其他有机溶剂互相替代。脱
7、水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。（六）透明透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质，可以将材料中的脱水剂置换出来，使石蜡能顺利进入材料中。二甲苯是目前应用最广的透明剂，作用迅速，但易使材料变脆。（七）（七）浸蜡是指逐步清除材料中的透明剂，以使石蜡充分渗透于材料内部的过程。这样，材料的各部分都能保持原来的结构与位置，切片不致发生破裂或其他变形。浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇。每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。（八）（八）包埋材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡块，以备切片。操作方法：根据切片材料大小，确定所
8、需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒。（九）切片（九）切片即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。（十）贴片是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上，是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色和观察。以便于染色和观察。常用的粘片剂有下列二种：常用的粘片剂有下列二种：(1)明胶黏片剂明胶黏片剂(2)蛋清黏片剂蛋清黏片剂（十一）染色 即根据植物细胞中不同的化学性质，用染料分别进行染色，以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等。染色基本程序为脱蜡、染色、分色封片。染色方法可分为下列几类：单染 只用一种染料染色。双重染色 两种染料染色，如番红-固绿；苏木精-曙红。多重染色 多种染料染色，如番红固绿桔红G；酸性品红苯胺蓝桔红G等。（十二）封藏封藏于中性树胶中，使材料能在显微镜下清晰地显示出来，并能长期保存。方法：将含材料的载玻片放在吸水纸上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（必须在二甲苯干燥前进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。