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1、关于基因诊断与基因关于基因诊断与基因治疗治疗第1页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/142主要内容主要内容n n第一部分 基因诊断n n第二部分 基因治疗第2页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/143概念：概念：基因基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定DNA序列。基因的改变，会导致各种表型的改变，进而引起疾病的发生。将基因或其组成部分发生异常的疾病统称为基因病。第3页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/144基因病分为三大类：基因病分为三大类：一、单基因病：单基因病：由单个基因突变引起的一类疾病。如：血友病、地中海贫血等。二、多基因病：多基
2、因病：由多个基因突变综合作用引起的 疾病。如：恶性肿瘤、高血压、动脉硬化、糖尿病、先天畸形等。三、获得性基因病：获得性基因病：指外源基因（DNA）侵入，在机体产生疾病，一旦将其清除便可痊愈。如：艾滋病及各种微生物感染病。第4页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/145第一部分 基因诊断 （DNA diagnosis）一、基因诊断的概念和基本概况临床诊断生化学诊断免疫学诊断临床疾病诊断四种方式：以疾病表型改变为依据。（细胞形态结构变化、代谢产物异常、特定蛋白分子识别差异等）基因诊断对患者基因直接分析第5页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/146基因诊断基因诊断基因基因蛋白质蛋白
3、质性状性状生化生化诊断诊断基因基因诊断诊断临床临床诊断诊断第6页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/147基因诊断定义（概念）：基因诊断定义（概念）：基因诊断基因诊断是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测患者体内基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断或辅助诊断的方法。基因诊断是在DNA/RNA水平检测分析基因的存在、结构变异和表达状态，与传统诊断方法比较有其特点：第7页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/148基因诊断的特点：基因诊断的特点：1 1、病因诊断：、病因诊断：、病因诊断：、病因诊断：直接瞄准病理基因，不仅对表型出现的疾病作出诊断，还可能发现潜
4、在的致病因素，如:确定有遗传家族史的人携带致病基因。2、特异性强、灵敏度高：、特异性强、灵敏度高：选用特定基因序列作为探针，单拷贝基因采用高度扩增PCR技术。3、稳定性高、稳定性高4、诊断范围广，适应性强、诊断范围广，适应性强目的基因是否处于活化状态均可。样品可长期保存。可检测正在生长的病原体或潜在病原体。（与以疾病表型改变为依据的 诊断技术相比）第8页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/149基因诊断的基本概况：伴随分子生物学理论技术的发展而建立和发展。DNA双螺旋 遗传密码破译 DNA重组 癌基因与抑癌基因研究 地中海贫血病基因治疗和逆转录病毒载体开发 PCR、分子杂交等一系列技术
5、发展第9页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1410二、基因诊断的对象二、基因诊断的对象1、病原生物的侵入、病原生物的侵入病原体：病毒、支原体、细菌、寄生虫检查诊断方法：显微镜、免疫学方法、基因诊断等。尤其是当无抗体时，基因诊断成为唯一手段。2、先天遗传性疾病、先天遗传性疾病遗传性疾病:发病的原因为特定基因的突变。第10页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1411肿瘤的发生：发病机理尚不清。初步认为是个别细胞基因突变而引起的 细胞无限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突变引起的疾病、后天基因突变引起的疾病（1）用核心顺序的串联重复序列组成探针进行杂交研 究，可同时检
6、出具有高度多态性位点。（2）用southern 杂交得到DNA指纹图谱个体识别、亲子鉴定、法医物证4、其他、其他遗传稳定，个体特异，因而用于法医和亲子鉴定。第11页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1412基因诊断的基本策略：基因诊断的基本策略：1、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因 这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦较清楚。如：已被克隆的病毒、细菌、霉菌和寄生虫的基因、与致病有关的癌基因、抗癌基因、地中海贫血、苯丙酮尿症等遗传病基因。第12页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14132、检测与某种遗传标志连锁的致病
7、基因、检测与某种遗传标志连锁的致病基因遗传连锁遗传连锁同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传-称连锁。染色体遗传连锁图染色体遗传连锁图用限制性内切酶酶切位点作遗传标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱。定位性克隆定位性克隆根据遗传连锁图进行定位性克隆，比较正常和异常基因的差别，可找出导致遗传病的分子缺陷。定位性克隆策略是当前基因诊断的重要基础。第13页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14143、检测表型克隆基因、检测表型克隆基因针对多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血压、癫痫、精神病、多种自身
8、免疫性疾病）。表型克隆技术表型克隆技术是将有关表型与基因结构结合，直接分离该表型的相关基因，并对疾病相关的一组基因进行克隆，然后用作多种探针，来诊断多基因遗传病。该策略既不需预先知道基因的生化功能或图谱定位，也不受基因数目及其相互作用方式的影响。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和异常基因组寻找两者之间的差异序列2、基因组错配筛选技术：寻找两者的全同序列，分离、鉴定与疾病相关的基因，确定导致疾病的分子缺陷第14页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1415基因诊断的基本步骤：基因诊断的基本步骤：1、获得待检样品：提取核酸（PCR提高 灵敏度)2、制备和标记核酸探针3、基因检测分析
9、第15页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1416三、基因诊断的常用技术三、基因诊断的常用技术n n核酸分子杂交核酸分子杂交n n聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）n n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）n n扩增片段长度多态性（扩增片段长度多态性（AFLP）n n等位基因特异的寡核苷酸（等位基因特异的寡核苷酸（ASO）n n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）n n基因芯片基因芯片第16页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14171、核酸分子杂交、核酸分子杂交原理：原理：利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质，利用核酸的变性、复性及碱基互补的性质
10、，用已知基因的核酸序列作用已知基因的核酸序列作探针探针，与变性后的，与变性后的单链基因组单链基因组DNA/RNA杂交，检测核酸样品杂交，检测核酸样品中是否存在与探针互补的同源核酸序列，进行中是否存在与探针互补的同源核酸序列，进行DNA或或RNA定性定量分析。定性定量分析。基因检验的两个必要条件：1、必需的特异探针（标记的）2、必需的基因组DNA第17页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1418核酸分子杂交核酸印迹杂交核酸分子杂交核酸印迹杂交n nDNA印迹杂交（印迹杂交（印迹杂交（印迹杂交（Southern blotSouthern blot）n nRNARNA印迹杂交印迹杂交印迹杂
11、交印迹杂交 （Northern blotNorthern blot）n n斑点印迹杂交斑点印迹杂交 （Dot-blot）n n原位杂交原位杂交 (situ hybridization)(situ hybridization)第18页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14192.2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化分离、变性、转移、固化DNA片段片段杂交杂交加入标记核酸探针加入标记核酸探针检测杂交信号检测杂交信号标记核酸探针标记核酸探针预杂交预杂交制备核酸探针制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针漂
12、洗去除未参与杂交的标记探针第19页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1420核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交基本过程：提取DNA或RNA 酶切 凝胶电泳 胶变 性处理（DNA）转印核酸片段到NC膜上。（RNA可直接用变性胶电泳，转膜）（1）制备样品：第20页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1421核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交基本过程：（2）制备探针：）制备探针：探针：一段能和待检测核酸分子按碱基互补配对 原则而结合的核酸分子片段。探针需要标记可直接检测的元素或分子。如：同位素、荧光、生物素等第21页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1422核酸印迹杂交基
13、本过程：核酸印迹杂交基本过程：核酸印迹杂交可检测pg水平的靶分子（4）检测：方法依标记的探针而不同 *放射性同位素 *生物素 *地高辛 *荧光素（3）杂交：预杂交封闭非特异性结合位点 杂交探针与核酸分子结合第22页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1423（1）Southern印印迹迹杂杂交交法法第23页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1424（2 2）Northern Northern 印迹杂交法印迹杂交法 （Northern blotting Northern blotting）（其基本过程类似于上述（其基本过程类似于上述（其基本过程类似于上述（其基本过程类似于上述S
14、outhernSouthernSouthernSouthern法）法）法）法）提取提取提取提取RNARNARNARNA样本样本样本样本RNARNA变性变性变性变性琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离转移至转移至转移至转移至膜膜膜膜探针（标记探针（标记探针（标记探针（标记DNADNA或或或或RNARNARNARNA）与之杂交）与之杂交）与之杂交）与之杂交显影或显色显影或显色显影或显色显影或显色检测检测检测检测信号。信号。信号。信号。NorthernNorthernNorthernNorthern法可用于检测组织细胞中总法可用于检测组织细胞中总法可用于检测组织细
15、胞中总法可用于检测组织细胞中总RNARNA或或mRNAmRNA 第24页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1425（3 3）斑点杂交或狭缝杂交法：）斑点杂交或狭缝杂交法：基本过程：基本过程：基本过程：基本过程：将变性的将变性的将变性的将变性的DNADNA或或或或RNARNARNARNA直接点到固相支持滤膜上直接点到固相支持滤膜上直接点到固相支持滤膜上直接点到固相支持滤膜上用标记用标记用标记用标记探针与之杂交探针与之杂交探针与之杂交探针与之杂交自显影或显色反应自显影或显色反应自显影或显色反应自显影或显色反应检测杂交信号检测杂交信号检测杂交信号检测杂交信号分析结分析结分析结分析结果。果。
16、果。果。优点：优点：优点：优点：简便、快速、灵敏、样本用量少；简便、快速、灵敏、样本用量少；简便、快速、灵敏、样本用量少；简便、快速、灵敏、样本用量少；缺点：缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。特异性不高，有一定比例的假阳性。第25页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1426第26页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1427（4 4）菌落杂交）菌落杂交（colony hybridizationcolony hybridizationcolony hybridizationcolony hybridizatio
17、n）该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。第27页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1428（5 5）原位杂交）原位杂交（nucleic acid hybridization in situnucleic acid hybridization in situ）将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的特异的特异的特异的DNADNADNADNA或或或或RNARNARNARNA序列。序列。序列。序列
18、。细胞原位杂交细胞原位杂交细胞原位杂交细胞原位杂交 组织切片原位杂交组织切片原位杂交组织切片原位杂交组织切片原位杂交 DNA-DNADNA-DNADNA-DNADNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA RNA-DNA 三类杂交三类杂交三类杂交三类杂交 RNA-RNARNA-RNARNA-RNARNA-RNA 该法优点：该法优点：该法优点：该法优点：不需提取核酸，不需提取核酸，不需提取核酸，不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的
19、功能状态。准确地反映组织细胞的功能状态。准确地反映组织细胞的功能状态。准确地反映组织细胞的功能状态。有有第28页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1429第29页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1430第30页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14312、聚合酶链反应（、聚合酶链反应（PCR)原理：原理：以待扩增DNA为模板，在互补模板两端序列的寡核苷酸引物介导下，通过耐高温DNA聚合酶催化下，按半保留复制机制沿模板链延伸，快速、特异地扩增特定的DNA。一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术。（无细胞分子克隆技术）。第31页，讲稿共110张，创作于星期日2
20、022/9/1432耐高温耐高温DNA聚合酶聚合酶Taq酶酶寡核苷酸引物：设计引物和确定退火温度是PCR 成功的关键。PCR的基本过程：（循环程序）变性（95）退火（5565）延伸（72）35分401分100bp/1分源自水栖高温菌，最适反应温度为72，且经90以上加温后仍可在温度恢复后复性。第32页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1433（1 1）DNADNA模板的模板的变性变性 将待扩增将待扩增将待扩增将待扩增DNADNADNADNA加热到加热到加热到加热到959595950 0 0 0C C C C左右，使双链左右，使双链左右，使双链左右，使双链DNADNADNADNA解开成
21、为单链解开成为单链解开成为单链解开成为单链（即：使模板（即：使模板（即：使模板（即：使模板DNADNADNADNA或延伸后的双链或延伸后的双链或延伸后的双链或延伸后的双链DNADNADNADNA发生热变性发生热变性发生热变性发生热变性 ），），），），并游离于反并游离于反应体系中作为模板；应体系中作为模板；（2 2）模板与引物的结合（）模板与引物的结合（退火或复性退火或复性）将将体体系系温温度度降降至至合合适适温温度度（555555550 0 0 0C C C C左左左左右右右右），使使使使加加加加入入入入的的的的引引引引物物物物与与与与模模模模板板板板DNADNA两两两两端端端端（3333端
22、端端端）碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列互互互互补补补补结结结结合合合合。（由由由由于于于于加加加加入入入入的的的的引引引引物物物物量量量量远远远远多多多多于于于于模模模模板板板板量量量量，所所所所以以以以引引引引物物物物与与与与模模模模板板板板的的的的结结结结合合合合比比比比例例例例远远远远大大大大于于于于模模模模板板板板自自自自身身身身的复性）；的复性）；的复性）；的复性）；第33页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1434（3 3）引物）引物延伸延伸 将将将将体体体体系系系系温温温温度度度度升升升升到到到到727272720 0 0 0C C左左左左右右右右，TaqTaqTaq
23、Taq聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶催催催催化化化化dNTPdNTP按按按按碱碱碱碱基基基基互互互互补补补补原原原原则则则则连连连连接接接接在在在在DNADNA引引引引物物物物3333端端端端，使使使使引引引引物物物物延延延延伸伸伸伸，形形形形成成成成两两两两条条条条与模板互补的新链。与模板互补的新链。与模板互补的新链。与模板互补的新链。以上为一次以上为一次PCRPCR循环循环循环循环（变性、复性和延伸）（变性、复性和延伸）（变性、复性和延伸）（变性、复性和延伸）（新合成的链可作为下一轮循环的模板）（新合成的链可作为下一轮循环的模板）（新合成的链可作为下一轮循环的模板）（新合成的链可作为下一轮循环的
24、模板）按照上述步骤重复操作，按照上述步骤重复操作，按照上述步骤重复操作，按照上述步骤重复操作，PCRPCR产物呈指数扩增。模板产物呈指数扩增。模板产物呈指数扩增。模板产物呈指数扩增。模板DNA DNA 扩增倍数扩增倍数T=2n n(n:(n:循环次数循环次数循环次数循环次数)。第34页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1435 PCRPCR技术原理示意图技术原理示意图第35页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1436 2.PCR2.PCR各要素及其作用各要素及其作用（1 1 1 1）模板模板 PCRPCRPCRPCR模板可以是模板可以是模板可以是模板可以是DNADNADNA
25、DNA或或RNARNA。以线性以线性以线性以线性DNADNADNADNA模板为佳，量适中，一般为模板为佳，量适中，一般为模板为佳，量适中，一般为模板为佳，量适中，一般为101010102 2 101010105 5 5 5个拷贝；个拷贝；个拷贝；个拷贝；RNARNARNARNA作为模板时，需要：作为模板时，需要：作为模板时，需要：作为模板时，需要：RNA cDNA PCR,RNA cDNA PCR,RNA cDNA PCR,RNA cDNA PCR,称此为称此为RT-PCRRT-PCRRT-PCRRT-PCR.（2 2）耐热）耐热DNADNA聚合酶聚合酶(Taq DNA(Taq DNA聚合酶聚
26、合酶)是是是是从从从从耐耐耐耐热热热热细细细细菌菌菌菌体体体体内内内内提提提提取取取取的的的的一一一一种种种种DNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶，可可可可在在在在95稳稳稳稳定定定定30分分钟钟。从从而而保保证证PCRPCR在在在在9494变变变变性性性性 5555退退退退火火火火7171延延延延伸伸伸伸 循环循环3030次过程中不变性失活。次过程中不变性失活。次过程中不变性失活。次过程中不变性失活。在在PCRPCR中，中，中，中，Taq DNATaq DNA聚合酶应用最广泛。聚合酶应用最广泛。聚合酶应用最广泛。聚合酶应用最广泛。逆转录逆转录第36页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14
27、37（3 3）引物）引物 引物是根据已知序列的模板引物是根据已知序列的模板DNADNA待扩增区两端待扩增区两端而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为而设计的一对寡核苷酸小片断，长度一般为1515 3030个碱基。个碱基。引物是引物是保证保证PCRPCR扩增产物的大小和特异性的扩增产物的大小和特异性的关键因素，其设计与合成对关键因素，其设计与合成对PCRPCR的成功至关重要。的成功至关重要。引物设计原则如下：引物设计原则如下：第37页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1438 引物设计应符合以下基本原则：引物设计应符合以下基本原则：长度适宜，一般为长度适宜，一般为15 30个碱基；个碱
28、基；G+C含量，一般为含量，一般为40 60；4种碱基应随机性分布；种碱基应随机性分布；引物自身不应存在互补序列；引物自身不应存在互补序列；两个引物之间不应有多于两个引物之间不应有多于4个碱基的互补；个碱基的互补；引物引物3端不应有任何修饰；端不应有任何修饰；引物引物5可以修饰。可以修饰。第38页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1439（4 4）缓冲溶液与）缓冲溶液与MgMg2+2+PCRPCR技技 术术 常常 用用1010 50mmol/L 50mmol/L Tris-HClTris-HCl、pH8.3pH8.3 8.888.88偏偏碱碱缓缓冲冲液液；并并含含有有一一定定量量的的
29、MgMg2+2+浓度；浓度；（5 5）dNTPdNTP浓度浓度 PCRPCRPCRPCR一一般般用用50505050 200200200200mol/Lmol/Lmol/Lmol/L的的的的dNTPdNTPdNTPdNTP；并并且且4 4 4 4种种种种dNTPdNTPdNTPdNTP浓浓度度应相等；应相等；第39页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1440（6 6）参数）参数 变性温度与时间变性温度与时间变性温度与时间变性温度与时间 一般选择：一般选择：一般选择：一般选择：949494940 0 0 0C C C C，3030秒秒秒秒 退火温度与时间退火温度与时间 取决于引物长度、
30、浓度取决于引物长度、浓度取决于引物长度、浓度取决于引物长度、浓度 和和和和G+CG+CG+CG+C含量，含量，含量，含量，一般选择：一般选择：Tm-5Tm-5Tm-5Tm-5 延伸温度与时间延伸温度与时间延伸温度与时间延伸温度与时间 一般选择：一般选择：一般选择：一般选择：70707070 75757575循环次数循环次数循环次数循环次数 取决于模板浓度，取决于模板浓度，取决于模板浓度，取决于模板浓度，一般循环：一般循环：一般循环：一般循环：30303030次次次次第40页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1441 PCRPCR操作操作 各种各种PCRPCR反应的操作基本相同，只是根
31、据反应的操作基本相同，只是根据 引物与靶序列不同，引物与靶序列不同，选择不同的反应体系和循环参数。选择不同的反应体系和循环参数。将将PCRPCR反应管置于反应管置于DNADNA自动化热循环仪上，输入各种循环自动化热循环仪上，输入各种循环参数，使参数，使DNADNA扩增在热循环仪上很方便地完成。扩增在热循环仪上很方便地完成。PCRPCR技术优点技术优点 特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对样本质量要求不高，能快速、特异地扩增任何能快速、特异地扩增任何DNADNA片断。片断。PCRPCR缺点缺点 由于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。由
32、于高灵敏度，使易出现假阴性或假阳性结果。第41页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1442 3.PCR3.PCR产物分析产物分析（1 1 1 1）凝胶电泳分析法）凝胶电泳分析法）凝胶电泳分析法）凝胶电泳分析法 可可可可用用用用琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖（AgroseAgroseAgroseAgrose）或或或或聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺（PAGEPAGEPAGEPAGE）凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳检测检测检测检测PCRPCR扩增产物的大小。扩增产物的大小。同同时时应应以以标标准准DNADNADNADNA分分子子量量作作平平行行对对照照，凝凝胶胶中中加加入入溴化乙锭，
33、电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。（在在在在待待待待检检检检靶靶靶靶序序序序列列列列拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数多多多多、且且且且仅仅仅仅扩扩扩扩增增增增出出出出一一一一条条条条带带带带时时时时，用用用用此此此此法法法法即即即即可可可可满满满满足足足足检检检检测要求。测要求。测要求。测要求。）第42页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1443（2 2）点杂交分析法）点杂交分析法 该法有该法有2 2种：种：将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一将扩增产物直接固定在膜上，每一个探针制备一张膜，然后用不同的特异探针进行杂交；张膜，然后用不同的
34、特异探针进行杂交；将不同的探针固定在膜上，再用有标记的将不同的探针固定在膜上，再用有标记的PCRPCR产物产物 与与之杂交。之杂交。本法有助于检测突变本法有助于检测突变DNADNA类型，用于人类遗传病诊断类型，用于人类遗传病诊断合某些基因的分析。合某些基因的分析。(当扩增产物时多条带时，用此法更合适。当扩增产物时多条带时，用此法更合适。)第43页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1444（呈2n 扩增速度）PCR基本过程和原理特点：特异性强 灵敏度高样品可以是：毛发、血痕 单细胞、病原体、肿瘤残留物、犯罪现场遗留物第44页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1445基因诊断中
35、常用的PCR技术：（1）、）、DNA PCR：（2）、）、RT-PCR：以DNA为模板，扩增特定核苷酸序列。用于检测特定基因片段的存在，分析鉴定基因突变。以总RNA或mRNA为模板，逆转录为cDNA后扩增。用于检测特定基因表达水平的主要方法之一。（3）、）、PCR-SSCP：检测基因未知突变的常用技术。简单、快捷、灵敏。第45页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1446（4）、多重）、多重 PCR：指在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA序列上不同序列片段的一种PCR技术。用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。（5）、原位）、原位 PCR：直接用组织切片和细胞进行PCR或RT
36、-PCR，在组织、细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特点基因序列。（6）、实时定量）、实时定量 PCR：借助特异性结合DNA的荧光染料，实时动态检测PCR扩增的DNA量的变化。第46页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1447其他重要的其他重要的PCR衍生技术衍生技术反向PCR（IPCR）标记引物PCR（labelled primers PCR）锚定PCR（anchored PCR）差异展示PCR（DD-PCR）第47页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14483、限制性片段长度多态性、限制性片段长度多态性（RFLP）检出方法：Southern 印迹概念：概念：用同一限制性内切酶
37、完全切割同一物种的不同个体的基用同一限制性内切酶完全切割同一物种的不同个体的基因组因组DNA，出现分子质量不同的同源片段，这种由，出现分子质量不同的同源片段，这种由限制性内切酶酶切位点变化导致的限制性内切酶酶切位点变化导致的DNA片段差异，片段差异，称限制性片段长度多态性（称限制性片段长度多态性（RFLP）。）。人类基因组中由人类基因组中由中性突变中性突变导致个体间核苷酸导致个体间核苷酸的差异称的差异称DNA多态性多态性第48页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1449RFLP类型：类型：2、由于链内发生较大片段的缺失、重复、插入和重 排导致DNA顺序的变化，因而酶切片段改变 序列多
38、态性。1、单个碱基的突变引起酶切位点的变化 点多态性致病基因附近或内部一般存在RFLP，可用于连锁分析的基因诊断。第49页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14504、扩增片段长度多态性（、扩增片段长度多态性（AFLP）应用于基因突变性质不明的连锁分析。应用于基因突变性质不明的连锁分析。AFLP串联重复的短片段的长度多态性通过PCR扩增,经限制性内切酶酶切后电泳,产生显示扩增片段多态性。第50页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1451AFLP原理：原理：首先利用可产生首先利用可产生首先利用可产生首先利用可产生粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端的限制性内切酶酶切研究对象的的限
39、制性内切酶酶切研究对象的的限制性内切酶酶切研究对象的的限制性内切酶酶切研究对象的基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶基因组序列，产生不同长度的酶切片段。然后，将这些酶切片段与含有与其有共同粘性末段的切片段与含有与其有共同粘性末段的切片段与含有与其有共同粘性末段的切片段与含有与其有共同粘性末段的人工接头连接人工接头连接人工接头连接人工接头连接，形成，形成，形成，形成模板模板模板模板。为达到。为达到。为达到。为达到选择性选择性选择性选择性扩增的目的，再在模板末端添加具有扩增的目的，再在
40、模板末端添加具有扩增的目的，再在模板末端添加具有扩增的目的，再在模板末端添加具有选择性核苷酸（选择性核苷酸（选择性核苷酸（选择性核苷酸（1 13 3个）的不同引物个）的不同引物个）的不同引物个）的不同引物，然后，然后，然后，然后PCRPCR扩增，结果扩增，结果扩增，结果扩增，结果只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。只有那些两端序列与选择性核苷酸配对的酶切片段被扩增。最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其最后将被
41、扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其最后将被扩增的片段在高分辨率的测序凝胶上电泳，这样其多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。多态性即根据扩增片段的长度与数量的不同而被分开。PCR扩增产物即等位片段之间差别只有几个bp。第51页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14525、等位基因特异的寡核苷酸、等位基因特异的寡核苷酸（ASO）方方法：法：1、合成两种探针：已知突变位点的核苷酸序列（M）正常基因碱基序列（N）2、杂交实验结果：M+N-受检者是突变基因的纯合子 M-N+受检
42、者是不存在突变基因M-N-受检者的缺陷基因可能是一种新的突变类型M+N+受检者是突变基因的杂合子原理：原理：已知基因突变部位和性质，合成基因特异的核苷酸探针（20bp），标记后与受检者DNA杂交诊断。（可与PCR联用：PCR-ASO）第52页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14536、单链构象多态性（、单链构象多态性（SSCP）日本日本日本日本OritaOrita等研究发现，单链等研究发现，单链等研究发现，单链等研究发现，单链DNADNA片段呈复杂的空片段呈复杂的空片段呈复杂的空片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或少间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或
43、少间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或少间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链异的单链异的单链异的单链DNADNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分可以非常敏锐地将构象上有
44、差异的分子分可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。离开。离开。离开。PCR-SSCP第53页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1454PCR-SSCP基本过程基本过程PCR扩增靶扩增靶扩增靶扩增靶DNADNA；将特异的将特异的将特异的将特异的PCR扩增产物变性后快速复性；扩增产物变性后快速复性；扩增产物变性后快速复性；扩增产物变性后快速复性；将单链将单链将单链将单链DNADNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析通过放射性
45、自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链结果。若发现单链DNADNA带迁移率与正常对照的相带迁移率与正常对照的相带迁移率与正常对照的相带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该断该断该断该DNADNA片段中有碱基突变。片段中有碱基突变。片段中有碱基突变。片段中有碱基突变。第54页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14557、基因芯片、基因芯片（生物集成模片、DNA阵列、或寡核苷酸微芯片）基本原理：基本原理：指将大
46、量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测根据杂交分子和未杂交分子信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。第55页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1456基因芯片技术：基因芯片技术：第56页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1457目的：检测外源性基因的侵入目的：检测外源性基因的侵入目标：1、微生物2、病毒 如：HIV（致艾滋病 AIDS）3、寄生虫、4、不易体外培养的病原体（毒性大肠杆菌、麻风分枝 杆菌）5、实验室培养的病原体（克立氏体）四、基因诊断的 临床应用:1、在感染性疾病检测中应用第57页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1458艾
47、滋病与HIV病毒艾滋病由HIV通过接触、血液、血制品及母婴传播感染所致。HIV特异地侵犯辅助性T细胞（CD4），引起人体细胞免疫严重缺陷，导致顽固的机会性感染，恶性肿瘤和神经系统损伤。HIV 感染后，95%感染者5个月可检出抗体（也有3-4年仍不能检出抗体）。有必要进行PCR技术检测。第58页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1459艾滋病与艾滋病与HIV病毒病毒检测技术：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的设计：应在保守区（基因：pol,env,gag,tat)病毒特点：病毒特点：HIV病毒由两条单链RNA组成，9.7k/RNA，主要基因结构和组成形式与其他逆转录病
48、毒相同，但较之复杂，故称复杂反转录病毒HIV属反转录病毒即单链RNA反转录成双链DNA，进入宿主细胞染色体。第59页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1460非典型性肺炎（SARS）由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）引起，多种途径传播，传染性强、高致死率的急性疾病。诊断依靠：流行病学、临床表现、放射诊断、血清学（荧光免疫、ELISA）PCR作为一种灵敏的早期病原学诊断必不可少 （关键是引物的合成）第60页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14612、在遗传病检测中的应用、在遗传病检测中的应用n 产前诊断 检测妊娠812周的绒毛DNA或羊水细胞 PCR诊断一系列遗传疾病n
49、 镰刀状细胞贫血的诊断 方法：RFLP诊断 Mst酶切识别序列：CCTNAGG 切割正常链序列：CCTGAGG 不切割突变序列：CCTGTGG ASO探针诊断第61页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/14623、在肿瘤检测中的应用、在肿瘤检测中的应用原癌基因原癌基因 生物正常细胞基因中编码关键性调控蛋白的癌基因抑癌基因抑癌基因 一类抑制细胞增殖的基因，其失活可引起细胞转化。两类基因协同调控，使细胞生长处于平衡状态。第62页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1463癌基因激活变化及检测：癌基因激活变化及检测：1、基因扩增：即染色体某区段基因拷贝数增加，或癌基 因的扩增。检测方
50、法：Southern 杂交 定量PCR2、基因的过量表达：包括基因扩增基础上的过量表达及非 DNA水平的过量表达。检测方法：Northern 杂交 RT-PCR3、点突变：检测方法为各种基于PCR的方法。第63页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1464抑癌基因的检测：抑癌基因的检测：Southern PCR大片段的缺失和点突变*两个等位抑癌基因突变才能引起肿瘤，需检出两个等位抑癌基因。方法：RFLP结合PCR，进行缺失检测 点突变主要采用PCR第64页，讲稿共110张，创作于星期日2022/9/1465肿瘤标志物：肿瘤标志物：指特征性存在于恶性肿瘤或由恶性肿瘤细 胞异常产生的物质或