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1、QB-C -QD-SOP-053 版本号01修订号00文件名称：磷脂检验标准操作规程文件编码：QB-C-QD-S0P-053起草人：凌彩霞 日期：2015年11月20日版本号/修订号：OO/01审核人：洪光宇 日期：2015年11月22日制定部门：质量管理部批准人：洪光宇 日期：2015年11月22日 1.目的 制定磷脂的检验操作规程，确保生产质量 2.适用范围 本规程适用于磷脂的质量评价与质量控制 3.职责 质量管理部负责本规程的实施。 4.正文 4.1 外观取适量试样，置于清洁、透明的玻璃器皿中，在自然光线下，目视观察其色泽和状态，嗅其气味。4.2含量测定4.2.1试剂4.2.1.1 正己
2、烷：色谱纯。4.2.1.2 异丙醇：色谱纯。4.2.1.3 水：色谱纯。4.2.1.4 冰醋酸：色谱纯。4.2.1.5 1冰醋酸溶液：1ml冰醋酸用色谱纯水定容到100ml。4.2.1.6 磷脂酰胆碱：标准物质，纯度99。4.2.1.7 流动相：V(正己烷)+V(异丙烷)+V(1冰醋酸溶液)=8+8+1。4.2.2仪器与设备4.2.2.1 分析天平：精度为0.0001g。4.2.2.2 刻度吸管：0.5ml，1ml，5ml。4.2.2.3 容量瓶：5ml，10ml，100ml。4.2.2.4量筒：100ml，500ml，1000ml。4.2.2.5 液相色谱仪。 4.2.2.6 液相色谱柱：S
3、i-60柱子，填料粒度为5um。长度250mm，内径4.6mm。4.2.3分析步骤4.2.3.1 标准溶液的配制精确称取约20mg磷脂酰胆碱，用V(正己烷)+V(异丙醇)+V(1冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶剂溶解并定容到10ml，配制磷脂酰胆碱标准溶液，使溶液中磷脂酰胆碱为2mg/ml。准确吸取此溶液0.25ml、1.25ml、2.50ml、3.75ml、5.00ml，并用V(正己烷)+V(异丙烷)+V(1冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶剂定容到5ml，使溶液中磷脂酰胆碱的最终浓度为0.1mg/ml2.0mg/ml。低于16保存备用，保存时注意容器口的密封。 4.2.3.2 标准工作曲线的制作
4、分别取不同浓度的磷脂酰胆碱标准溶液10uL注入液相色谱中。以样品组分浓度为横坐标，组 分峰面积为纵坐标，绘制磷脂酰胆碱的标准工作曲线。 4.2.3.3 样品前处理测试样品应避光放在密闭和防潮的容器内。样品在使用前需充分混匀。依据样品中磷脂酰胆碱含量，精确称取样品15mg50mg。用V(正己烷)+V(异丙醇)+V(1冰醋酸 溶液)=8+8+1混合溶剂溶解并定容至5ml。低于16保存备用，保存时注意容器口的密封。 4.2.3.4测定色谱条件：Si60柱子，长250mm，内径4.6mm，填充物粒度5um。流动相流速1ml/min，柱温30，紫外检测波长205nm。进样：准确取经0.45um微孔膜过滤
5、的待测液10uL，注入液相色谱仪，比较待测液与标准样品的高效液相色谱（HPLC）图谱，取与标准样品HPLC图谱中磷脂酰胆碱相同时间的峰面积与标准工作曲线比较定量，对同一样品至少进行两次测定。 4.2.4结果计算试样中磷脂酰胆碱的含量以组分的质量与试样原有质量的质量分数表示，其计算公式为： %X ： 样品中磷脂酰胆碱的含量，%； c： 由磷脂酰胆碱标准工作曲线上查出的试样测定液中磷脂酰胆碱的浓度，单位为毫克每毫升（mg/ml）； 5 ：样品的定容体积，单位为毫升（ml）； m ：样品的总质量，单位为毫克（mg）。 4.3 正己烷不溶物 4.3.1 试剂和材料 正己烷。4.3.2 仪器和设备4.3
6、.2.1 抽滤器：500 mL。4.3.2.2 玻璃砂芯坩埚：G3。4.3.3 分析步骤4.3.3.1 将清洁的坩埚在101 105 烘箱中烘至恒重。4.3.3.2 称取混合均匀的试样10.0 g，精确至0.0001 g，置于烧杯中，加入正己烷约100 mL，用玻璃棒搅拌溶解后，通过已恒重的坩埚抽滤。4.3.3.3 用25 mL正己烷分两次洗涤烧杯和玻璃棒并将不溶物全部移入坩埚内，用正己烷洗涤坩埚内壁和不溶物，最后尽量抽除坩埚内残留正己烷。4.3.3.4 取下坩埚，用脱脂棉沾少许正己烷擦净坩埚外壁。将坩埚于101 105 烘箱中烘干1 h，取出，放入干燥器中冷却至室温，称重。再烘干20 min
7、，冷却，称重，直至恒重。4.3.4 结果计算正己烷不溶物含量以质量分数w1 计，数值以%表示，按公式（1）计算：（1）式中：m1空坩埚及不溶物总质量的数值，单位为克（g ）；m2空坩埚质量的数值，单位为克（g ）；m 试样质量的数值，单位为克（g）。实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5 %。4.4 丙酮不溶物：4.4.1 方法原理用冷丙酮洗除油脂等丙酮可溶物，再扣除正己烷不溶物，剩余物为丙酮不溶物。4.4.2 试剂4.4.2.1 丙酮。4.4.2.2 石油醚。4.4.2.3 磷脂饱和丙酮(以下简称饱和丙酮)。4.4.24
8、粉状磷脂:用50 mL烧杯称取约2g流质磷脂，加10 ml石油醚溶解，加25 mL丙酮，析出磷脂。抽滤器上装好G3漏斗，用80 mL丙酮分数次抽滤。4.4.2.5 磷脂饱和丙酮溶液:取1g粉状磷脂于1 000 mL磨口瓶中，加1000 mL丙酮，在(0-5)冰水浴浸泡2h，约隔15 min摇动一次。约过2h后，用快速滤纸过滤，滤液于(0-5)冷藏，备用。4.4.3 仪器设备4.4.3.1 分析天平:感量0.0001 g.4.4.3.2 抽滤器。4.4.3.3 0冰水浴。4.4.3.4 水浴。4.4.3.5 玻璃砂芯坩埚:G3,4.4.4 分析步骤4.4.4.1 将烧杯、玻璃棒和坩埚，在(100
9、一105)烘箱中烘至恒重。4.4.4.2 称取刚混合均匀试样(1.9- 2.0) g(精确至0.0005g)于已恒重的烧杯中(连同玻璃棒)。加(0-5)饱和丙酮30 ML，在冰水浴内用玻璃棒采取搅拌与碾压相结合的方法用力碾压试样，要在2 min内使试样中大部分油溶出。将溶液迅速用已恒重的坩埚轻度抽滤，不要把颗粒状的不溶物带入坩埚。用(0-5)饱和丙酮20 mL冲洗坩埚内壁。4.4.4.3 在上述烧杯中再加(0-5)饱和丙酮20 mL，在冰水浴中用玻璃棒同上法继续碾压试样(2-3)min，待不溶物沉下，将溶液通过原坩埚抽滤。4.4.4.4 按4.4.4.3方法重复两次，要将不溶物全部碾成细粉。最
10、后一次碾洗后，取约。1 mL清液滴在玻璃上快速蒸发丙酮。如留有油迹，则再按5.4.3法碾洗试样直至检查无油残迹。4.4.4.5 将不溶物搅起移入坩埚中抽滤，用(0-5)饱和丙酮30 mL分两次洗涤过滤柑塌、玻璃棒、烧杯和不溶物(尽量将不溶物移入坩埚)，最后加强抽滤，抽除残留丙酮。4.4.4.6 将坩埚取下，用干净纱布沾少许丙酮擦净坩埚和烧杯外部，用玻璃棒将坩埚内沉淀物搅松。将盛有沉淀物的坩埚和附有残留不溶物的玻璃棒及烧杯立即置于(100-105)C烘箱中烘干30 min。取出，放人干燥器内冷却至室温，称重。再烘干20 min，冷却，称重，直至恒重。4.4.5.结果计算式中:X 丙酮不溶物含量，
11、%;m3: 干燥后坩埚、饶杯、玻璃棒和沉淀物的总质量，g；m4: 空的坩埚、烧杯、玻璃棒总质量，g；m : 试 样 质 量，g；E : 正己烷不溶物含量，%.4.4.6 允许差:平行试验允许差为0.5%.4.5 酸值的测定4.5.1 试剂和材料4.5.1.1 石油醚。4.5.1.2 氢氧化钠标准滴定溶液：c(NaOH)=0.1 mol/L。4.5.1.3 中性乙醇：质量分数为95%。使用前以酚酞指示液作指示剂，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至溶液呈微红色，并维持5 s不褪色为终点。4.5.1.4 酚酞指示液：10 g/L。4.5.2 分析步骤 称取约2 g混合均匀的试样，精确至0.001 g，置于
12、250 mL锥形瓶中，加入50 mL石油醚，轻轻振摇使之溶解，然后加入50 mL中性乙醇，摇匀。加入4滴酚酞指示液，用氢氧化钠标准滴定溶液快速滴定，边滴边振摇，接近终点时，减慢滴定速度至每次12滴，至粉红色出现并维持5 s不褪色即为终点。4.5.3 结果计算 酸值以氢氧化钾（KOH）的质量分数w2计，数值以毫克每克（mg/g）表示，按公(1)计算：（2）式中：V滴定时消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；c氢氧化钠标准滴定溶液浓度的数值，单位为摩尔每升（mol/L）；56.1 氢氧化钾的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（g/mol）M（KOH）=56.1；m0试样质量的数值，
13、单位为克（g）。实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5 %。4.6 过氧化值的测定4.6.1 试剂和材料4.6.1.1乙酸与三氯甲烷混合液：体积比3：2，将3份冰乙酸与2份三氯甲烷混合。4.6.1.2 饱和碘化钾溶液：新配制且不得含有游离碘和碘酸盐。确保溶液中有结晶存在，存放于避光处。如果在30 mL乙酸与三氯甲烷混合液中加入0.5 mL饱和碘化钾溶液和2滴淀粉指示液，若溶液出现蓝色并需要硫代硫酸钠标准滴定溶液1滴以上才能消除，则需重新配制此溶液。4.6.1.3 硫代硫酸钠标准滴定溶液：c(Na2S2O3)=0.01 mol
14、/L，将c(Na2S2O3)=0.1 mol/L的硫代硫酸钠标准滴定溶液稀释10倍制得。4.6.1.4 淀粉指示液：10 g/L。注：上述所有试剂和水中不得含有溶解氧。4.6.2 仪器和设备实验室常规仪器。使用的所有器皿不得含有还原性或氧化性物质。磨砂玻璃表面不得涂油。4.6.3 分析步骤称取约5g混合均匀的试样，精确至0.001 g，置于250 mL碘瓶中，加入30 mL冰乙酸与三氯甲烷混合液，振摇使试样充分溶解。加入0.5 mL饱和碘化钾溶液，紧密盖塞反应1 min，反应过程中至少轻摇碘瓶3次。然后立即加入30 mL水和0.5 mL淀粉指示液，用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定，边滴边振摇，临近
15、终点时，不断振摇使所有的碘从溶剂层释放出来，逐滴添加硫代硫酸钠标准滴定溶液至溶液蓝色消失，即为终点。同时进行空白试验，当空白试验消耗的硫代硫酸钠标准滴定溶液超过0.1 mL时，应更换试剂重新对试样进行测定。4.6.4 结果计算过氧化值以w3计，数值以每千克中活性氧的毫克当量（meq/kg）表示，按公式（3）计算：式中：V滴定试样所消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；V0滴定空白所消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积的数值，单位为毫升（mL）；c 硫代硫酸钠标准滴定溶液浓度的准确数值，单位为摩尔每升（mol/L）；m3试样质量的数值，单位为克（g）；1000 换算因子。实验结果以
16、平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5 %。 4.7干燥失重 4.7.1. 仪器和试剂 4.7.1.1 分析天平：感量0.00001g； 4.7.1.2电热鼓风干燥箱； 4.7.1.3扁形称量瓶； 4.7.1.4 干燥器 4.7.2 测定步骤 取供试品混合均匀，精密称取约1g，置于预先在105烘箱中干燥至恒重的扁形称量瓶中（供 试品平铺厚度不可超过5mm，于105干燥箱中干燥2小时。干燥时，将瓶盖半开或取下，置称 量瓶旁。取出时，将称量瓶盖好，置干燥器中放冷至室温（约30min），精密称重。再放入105干燥箱干燥0.5小时，取出冷却，
17、称重，至连续两次称重的差异不超过2mg为止。从减失的重量和取样量计算供试品干燥失重。 4.7.3 计算 W1：干燥前样品的质量（g） W2： 干燥后样品的质量（g） 4.8 残留溶剂测定 4.8.1仪器和试剂： 4.8.1.1气相色谱仪、顶空进样器； 4.8.1.2超声波清洗仪：功率250W，频率40KHz； 4.8.1.3分析天平：感量0.00001g； 4.8.1.4容量瓶（50mL）； 4.8.1.5二甲基甲酰胺（色谱级）、正己烷、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、甲苯（分析级） 4.8.2 色谱条件 4.8.2.1 气相色谱仪分析条件色谱柱：DB-624 30m0.320mm1.8um
18、检测器：FID载气（N2）：25mL/Min氢气：40 mL/Min空气： 400mL/Min进样口温度：160检测器温度：250 色谱柱温度：45(0.3min) 150(4min) 230(5min) 4.8.2.2 顶空进样器条件 加热温度：90进样针温度：100 传输线温度：110样品瓶平衡：30 min进样持续时间：0.5minGC循环：35min 气体压力：25psi隔垫吹扫流量：3ml/ min 分流比：10:1 4.8.2.3 溶液制备混合对照品溶液制备 在50mL容量瓶中加入少量二甲基甲酰胺，用进样针根据以下标示量分别精密吸取正己烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、甲苯对照
19、品于容量瓶中，立即用二甲基甲酰胺溶解定容，作为混合对照品储备液。再精密量取混合对照品储备液5mL用二甲基甲酰胺稀释到50mL，即为混合对照品溶液。再精密吸取此溶液3mL于顶空进样瓶中加盖密封。溶剂比重吸取体积(L)混合对照品储备液浓度（mg/50ml）混合对照品溶液浓度 （mg/50ml）正己烷0.6605.03.30000.3300丙酮0.7905.03.95000.3950乙酸乙酯0.90010.09.00000.9000甲醇0.7902015.8001.5800乙醇0.7905039.5003.9500氯仿1.48420.029.6802.9680甲苯0.8667.56.49500.64
20、95 样品溶液制备 精密称取植物提取物样品约1g于顶空进样瓶中，准确加入3mL二甲基甲酰胺，立即加盖密封并超声20min。4.8.2.4 样品测定 在上述色谱条件下，等仪器稳定，就绪后开始测定。甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲苯保留时间分别在0.9min、1.4min、1.8min、1.3min、2.25min、2.45min、4.95.min左右。4.8.3 含量计算采用外标法计算含量。其中 A1：样品溶液中甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲苯的峰面积 A0：对照品溶液中甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲苯的峰面积 W1：样品的称样量 mg W0：对照品的称样量 mg V1：样品的体积 mL V0：对照品的体积 mL K： 对照品的纯度。4.9 微生物检验见微生物检验操作规程。第13页 共 页