DNA提取基本知识和方法.ppt

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1、,DNA extraction,ZJL 2014.05.09,细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白。 真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者为双链线性分子；后者为双链环状分子。 除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。,DNA extraction,极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，钠盐比游离核酸易溶于水。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。,核酸的理化性质,提取DNA总的原则 :,1

2、 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。,DNA提取的几种方法,基因组DNA的提取,非基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,基因组DNA的提取,根据裂解方式的不同有：,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,基因组DNA的提取,浓盐法： 有机溶剂抽提法： 密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,基因组DNA的提取,SD

3、S法流程图 （以动物组织为例）,动物组织,细胞裂解,上层溶液,组织匀浆,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNASDS法,Approximately 1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved; More Proteinase K may be added if digestion i

4、s not complete after 24 hr; Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfe

5、r the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times; A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; If there is no pellet, place samples in -80C for 10 min and s

6、pin at 13,000 rpm for 25 min at 4C; Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use 100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.,Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA,1.SDS ：十二烷基硫酸钠,2.Tris：缓冲液,3.EDTA,2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinas

7、e K, mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved;,作用：细胞裂解时PH值也能稳定,作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性,作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。,Tail solution:,3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;,Proteinase K :,作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。,4

8、. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; 5. Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT;,优点：1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分DNA,Phenol：,Chloroform：,1.加速有机相与液相分层。 2.去除DNA水溶液中残留的微量酚。,减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。,Isoamyl alcoh

9、ol：,7.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; 8.Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for min at RT; 9.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;,经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。,Chloroform：,10.Transfer the top aqueous phase to a fresh

10、microfuge tube, add 50 ml 3M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times; 11.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;,NaOAc (pH=6.0) :,1. 沉淀核酸，缩短乙醇沉淀的时间 2. 提供单价阳离子。减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，,100% ethanol,任意比和水相混溶，夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。 但是加其他比例的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失

11、也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。,12. If there is no pellet, place samples in -80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C; 13. Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; 14. Resuspend DNA in ddH2O.,DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。 2. 基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。,DNA的保存 ：,非基因组DNA的提取,碱裂解法 密度梯度离心法 煮沸法,质粒

12、DNA的提取,1、培养细菌使质粒扩增 -对数生长后期 2、收集和裂解细菌 3、质粒DNA的纯化,质粒DNA的提取-碱裂解法,1、培养细菌使质粒扩增 -对数生长后期 在含有相应抗性的液体培养基中培养已转化质粒的细菌(单克隆)，使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。,质粒DNA的提取-碱裂解法,2、收集和裂解细菌 非离子型/离子型去污剂 裂解 有机溶剂/碱 加热,质粒DNA的提取-碱裂解法,3 、质粒DNA的纯化 - CsCl-溴化乙锭梯度密度离心 取决于线状DNA与闭环DNA与溴化乙锭结合的量,质粒DNA的提取-碱裂解法,原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，

13、而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA的提取-碱裂解法,离心洗涤,质粒DNA的提取-碱裂解法,SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用,溶液 Resuspension Buffer 成分：50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl， pH=8.0 葡萄糖: 增稠。维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。 ED

14、TA : 二价金属离子的螯合剂，抑制DNase的活性。 有利于溶菌酶的作用。 这一步溶液中还可以加入RNase 溶菌酶：糖苷水解酶。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。,溶液 Lysis Buffer 成分 ：0.2M NaOH / 1% SDS NaOH ：溶解细胞，DNA变性 SDS ： (1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 (2)解聚细胞中的核蛋白。 (3)SDS能与蛋白质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS与NaOH联用：增强NaOH的强碱性,SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用,SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液的成分及作用,溶液

15、Neutralization Buffer 成分 ： 3M KAc / 2M HAc KAc : K+置换了SDS中的Na+，得到PDS沉淀 HAc : 中和NaOH,使DNA复性,吸附柱 Spin Column with Collection Tubes,结构： 特殊硅基质吸附材料，特异性吸附DNA，而RNA与蛋白质穿过。 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。,大提&小提,区别： 1. 大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。 2.一般试剂盒中大提比小提多了溶菌酶、异丙醇（回收沉淀核酸）、LiCl（特异性去除RNA）、含一定量P

16、EG的氯化物（回收质粒DNA）及乙酸铵等，其作用及目的都是有利于细菌的裂解和质粒的纯化，所以大提的产物比小提的量多很多，而且纯度很高。 3.小提一般用于质粒鉴定和对纯度要求不是很高的实验，大提用于质粒的大量提取和转染等纯度要求很高的实验。,* 内毒素的去除,内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性胞膜上一种成分，细菌外膜的外部脂质完全由内毒素分子组成。 包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。 细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。 内毒素会对原代细胞的DNA转染产

17、生严重影响，同样也会影响培养细胞的敏感性，内毒素水平增加可导致转染效率的大幅下降。,原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,煮沸法,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,差速离心法,Thank you !,