核酸提取基本知识及方法.ppt

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1、赢润生物 曾 林,核酸提取原理及方法,前言,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。,主要内容,核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取 琼脂糖凝胶电泳,核酸简介,核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，5- 磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。 DNA主要储存遗传信息。 RNA主要传递遗传信息。,核酸简介,核酸简介质粒DNA,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子

2、，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。,核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取,基因组DNA提取方法,基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法 SDS法 其他方法,基因组DNA提取CTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是

3、可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,基因组DNA提取CTAB法,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。,基因组DNA提取CTAB法,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减

4、少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB法实验流程,基因组DNA提取CTAB法,SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,基因组DNA提取SDS法,注：SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。,SDS提取缓冲液的配方,基因组DNA提取SDS法,Tris-HCl（pH8.0）：提供一个缓冲环境，

5、防止核酸被破坏； EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl：提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。,基因组DNA提取SDS法,SDS法实验流程（以动物组织为例）,基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测,小鼠gDNA电泳图,琼脂糖凝胶电泳： 以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。,基因组DNA提取常见问题,DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA降解 DNA量少,基因组DNA提取常见问题分析,DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质 抽提纯化、高盐洗涤 DNA在溶解

6、前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀 DNA中残留有金属离子 重新70%乙醇漂洗,基因组DNA提取常见问题分析,DNA降解,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染,DNA提取量少 实验材料不佳或量少 选取新鲜（幼嫩）材料 破壁或裂解不充分 充分研磨、破壁酶、延长裂解时间 沉淀不完全 低温、延长沉淀时间 洗涤使得丢失DNA,基因组DNA提取常见问题分析,核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取 琼脂糖凝胶电泳,质粒DNA提取,质粒DNA提取的方法： 碱裂解法 煮沸法,质粒DNA提取碱裂解法原理,离

7、心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理,离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。,质粒DNA提取及检测实验准备,1.实验器材 台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。 2.实验耗材 无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。 3.实验试剂 质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO) 、LB培

8、养基、抗生素、 琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、 TAE电泳缓冲液等。 4.实验材料 对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5）,质粒DNA提取碱裂解法,碱裂解法试剂配方,质粒DNA提取实验流程,离心,详细实验步骤请参考说明书！,质粒DNA提取电泳检测,琼脂糖凝胶电泳检测,质粒DNA的三种带型： 1.共价闭合环状DNA分子：质粒双链没有断裂；超螺旋结构；泳动速度最快； 2.半开环质粒DNA分子：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；泳动速度最慢； 3.线性DNA分子：质粒的两条链均断裂；泳动速度居中。,质粒DNA提取常见问题,RNA残留 质粒断裂 量少,

9、质粒DNA提取常见问题分析,RNA残留 忘记加RNase A？ I液中RNase A失效？ 酶量不够？,质粒DNA提取常见问题分析,质粒断裂 II 液裂解时间过长？ 裂解时动作过于剧烈？,质粒DNA提取常见问题分析,量少 凝胶是否有问题？ 菌体量少 菌体重悬不彻底 裂解不完全 菌株老化 严谨型质粒,质粒类型,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的

10、质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取 琼脂糖凝胶电泳,总RNA提取通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法） 原理： 核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向疏水性的酚层移动，而RNA由于有-OH的存在有亲水性，因此向水层移动。,TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可

11、抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA，有机层主要为DNA和蛋白质。,总RNA提取及检测实验准备,1.实验器材 台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、 marker笔、酒精喷壶、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。 2.实验耗材 1.5 mL EP管（RNase free）、各规格Tip （RNase free） 、 一次性手套、一次性口罩等。 3.实验试剂 TRIzol 总RNA提取试剂（YRBIO) 、氯仿、异丙醇、75%

12、乙醇 （RNase free）、DEPC H2O （RNase free） 等。 4.实验材料 新鲜293细胞,RNase是导致RNA降解的最主要物质！ RNase的来源 样品 试剂 多次使用的器具 裸露的手 说话产生的唾沫 空气,RNase非常稳定，它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。,总RNA提取去除RNase污染,玻璃器皿处理： 量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200烘烤2小时以上。 塑料器皿处理： 0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。 试剂处理： 氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后RNA专用。0.

13、1%DEPC水配制75%的酒精。 专用的RNA操作室、专用器械。 操作时戴口罩、手套、帽子、穿实验服。,总RNA提取样本准备,植物/动物组织样本： 新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80。 为避免反复冻融，需小份分装（50100 mg/份）。 细胞样本： 新鲜收集待用或加入TRIzol后 -80冻存细胞沉淀。 血液样本： 新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入TRIzol后 -80 冻存细胞沉淀。,真核细胞总RNA提取实验步骤,293细胞样品为例,收集细胞,上层溶液,离心洗涤,裂解变性,异丙醇沉淀,抽 提,RNA溶液,干燥溶解,详细实验步骤请参考说明书！,总RNA提取完整性检测,293细胞

14、总RNA,由于动物细胞中70-80% 的RNA为rRNA，后者又由28S（约4800 nt），18S（约1900 nt）和5.8S（约120 nt）三种组成，所以电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。 由于核酸长度与结合EB的数量成正比，所以28S rRNA条带的荧光强度一般比18S rRNA条带的荧光强度强1.5-2.3倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解（因为大的RNA被酶降解的可能更大）。,电泳检测,总RNA提取产量产率与纯度检测,1.打开紫外分光光度计设定参数，具体操作参照仪器说明。 2.取少量待测RNA样品，用TE Buffer稀释50倍（或100倍

15、）。 3.用TE Buffer做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。 4.加入待测RNA样品在三个波长处读取OD值。,总RNA提取产量产率与纯度检测,5.根据OD值计算RNA的浓度： SSRNA = 40 (OD260OD310) 稀释倍数 6.RNA产量产率计算： RNA 的产量= RNA浓度溶解体积 RNA的产率= RNA产量/细胞用量 7.根据OD值计算RNA的纯度 纯RNA样品的OD260/OD280 大约在1.8-2.0之间。,RNA提取常见问题,RNA降解 DNA残留 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常,RNA提取常见问题分

16、析,RNA降解 外源RNase的污染 裂解液质量 裂解液用量不足 样品本身富含RNase 环境温度过高,RNA提取常见问题分析,DNA残留 样本量过多 吸取到中间层及下层试剂 解决办法： DNA酶（RNase free）消化， 再抽提纯化处理。,RNA提取常见问题分析,OD260 /OD280 比值偏低 蛋白污染/苯酚残留 加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的离心力 和时间要足够。 不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失些上清。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。,RNA提取常见问题分析,电泳带型异常 上样量超过 3g 电压超过 8V/cm 电泳缓冲液陈旧

17、均可能导致 28S 和 18S 条带分不开,核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取 琼脂糖凝胶电泳,DNA的琼脂糖凝胶电泳,1.原理： DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形状的核酸，其移动速度有差异。因此，利用这种“电荷”和“分子筛”的双重效应，达到分离核酸的目的。,DNA的琼脂糖凝胶电泳,2. 琼脂糖凝胶分离DNA的范围,DNA的琼脂糖凝胶电泳,3.DNA染料 A:EB 溴化乙锭(Ethidium Bromide, EB）可以嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 EB染料

18、优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以直接加到样品中或胶中；价格低廉。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。,B：新型低毒染料： 如Gold View、SYBRGreen、SYBRGold等。 毒性较低，但价格较昂贵。 灵敏度较好，但不如EB。,DNA的琼脂糖凝胶电泳,4.琼脂糖胶液制备（1%，50 ml） 4.1 称取0.5 g琼脂糖，置于250 ml锥形瓶中，加入60 ml 1TAE电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶解。一般需反复煮沸3次，琼脂糖才能充分溶解。加热过程中要不时摇动，使附于瓶

19、壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发； 4.2 待胶液冷却至60左右时，加入5%的Gold View染料，混匀，既成琼脂糖胶液。,DNA的琼脂糖凝胶电泳,5.凝胶板的制备 5.1 将胶槽置于水平支持物上，将琼脂糖胶液倒入胶槽中，使凝胶厚度约为0.3-0.5 cm，赶走气泡后迅速插上梳子，让胶凝固。 5.2 待凝胶完全凝固后（约2030 min），小心从一侧取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，让液面高出胶面1 mm左右。,DNA的琼脂糖凝胶电泳,6.加样 取待检测样本适量，按照5份上样液搭配1份 6DNA Loading Buffer的比例混匀（注意不要产生气

20、泡），用微量移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换枪头，以防止交叉污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。,DNA的琼脂糖凝胶电泳,7.电泳 加完样后立即接通电源。控制电压小于8 V/cm，电流在100 mA以上。当溴酚蓝条带移动到凝胶2/3时，停止电泳。 8.成像 在紫外透射仪或凝胶成像系统上观察电泳结果。保存图像。,内容回顾,1.基因组DNA提取 CTAB法 SDS法 2.质粒DNA提取 碱裂解法（离心柱型） 3.总RNA提取 异硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法） 4.DNA的琼脂糖凝胶电泳,下午实验课（14:30-18:00） 质粒DNA提取及琼脂糖电泳分析,The End！ Thank You！ Any Questions？,