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1、核酸提取及常见问题分析,主讲人：刘召华 唐维（修改）,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。,前言,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,第一部分：DNA提取方法简介,DNA提取的几种
2、方法,基因组DNA的提取,CTAB法 SDS法 其它,DNA提取的几种方法,非基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,碱裂解法 煮沸法,线粒体、叶绿体DNA的提取,差速离心结合SDS裂解法,基因组DNA CTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白
3、、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组DNA CTAB法,褐变,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合
4、物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,基因组DNA CTAB法,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）,PVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。 在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。 同时向抽提液中加入还原剂-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，
5、使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNA CTAB法,SDS法原理,基因组DNASDS法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取缓冲液,2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。 3.加入150ul 的5mol/ LKac,
6、混匀, 冰浴15min 左右,SDS法流程图 （以动物组织为例）,基因组DNASDS法,基因组DNA其它方法,物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法,根据细胞裂解方式的不同有：,基因组DNA其它方法,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,硅质材料 阴离子交换树脂 磁珠,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,基因组DNA其它方法,浓盐法： 有机溶剂抽提法： 密度梯度离心法：,利用RNP和
7、DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂
8、解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分及作用,溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去 溶液 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 溶液III 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸 这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉
9、淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器DNA差速离心法,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法
10、。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策,DNA提取的基本步骤,I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放
11、 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加） 培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）,严谨性质粒和松弛性质粒,按照复制性质，可以把质粒分为两类： 一类是严紧型
12、质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒； 另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当 培养基
13、去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮 变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断 复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染 G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕猴桃大提，10000转20min） 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,核酸分离、纯化,蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理,多
14、糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。,核酸分离、纯化,多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,核酸分离、纯化,盐离子的去除
15、： 70的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前） 重新沉淀
16、DNA，让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对 策,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,对 策,原因,实验材料不
17、佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少。,对 策,原因,猕猴桃DNA提取实例,1.CTAB配方如上,配制好备用,65度水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 2.65水浴一个小时 3.氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量
18、把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 ，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。 用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存,猕猴桃基因组DNA,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,第三部分：RNA提取方法简介,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在
19、特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,步骤: 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。,RNA提取的通用方法,影响RNA提取的因素,材料： 新鲜，切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源
20、困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于70或20保存 如要多次提取，请分成多份保存 液氮长期保存，70短期保存,影响RNA提取的因素,影响RNA提取的因素,样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻 样品量适当，保证充分裂解 为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,影响RNA提取的因素,纯化： 在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速； 经典的纯
21、化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解； 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响RNA提取的因素,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策,内容,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,RNA降解,新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RN
22、ase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。 建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,RNA降解,冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,OD260 /OD280 比值偏低,蛋白质污染： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚
23、残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,OD260 /OD280 比值偏低,抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75% 乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 设备限制： 测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10 - 0.50 之间。此范围线性最好。 用水稀释样品： 测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,电泳带型异常,非变性电泳： 上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈
24、旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； 甲醛的质量不高 。,下游实验效果不佳,RNA 降解 抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,RT常见问题分析和解决方案,问题一：少量或没有RT-PCR产物,可能原因,解决方案,RT常见问题分析和解决方案,问题二：有非特异性带,引物和模板的非特异性退火 基因特异性引物设计较差 RNA中有基因组DNA的污染 形成引物二聚体 镁离子浓度太高,提
25、高反应的温度和特异性 提高引物的特异性 使用扩增级DNase处理RNA 设计在3端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度,可能原因,解决方案,RT常见问题分析和解决方案,问题三：产生弥散（smear）条带,第一链产物的含量过高 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增,常规PCR步骤中减少第一链产物的量 减少引物的用量 减少PCR的循环次数 提高退火温度 提取高质量RNA，防止被DNA污染,可能原因,解决方案,谢谢！,北京天为时代科技有限公司 http/www.tw-,本公司产品江苏地区特约代理商 南京天为生物科技有限公司 联系电话：025-86073713 84705301 84701501 24小时订货热线：13057585177 联系人：王彤 免费技术支持：800 810 2177,