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1、大肠杆菌0157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂（TSA-SB ）平板（或相当的培养基）上培养，37孵育箱培养14-18 小时；用同一个接种针/环,穿刺或接种于小螺帽管中的TSA、HIA或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。同时接种标准株H9812。第一天步骤 1 细菌的包埋1、 打开水浴摇床（54） 、水浴箱（ 56） 。2、 用 TE 缓冲液（具体试剂配方见附件）制备1%Seakem Gold:1%SDS 琼脂糖 .以配置 25ml体积为例说明,方法如下 : 1)准确称取0.25g Seakem Go
2、ld agarose,放入 250ml 的蓝盖瓶中 . 2)加入 22.5mlTE 缓冲液 ,轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开. 3)微松盖瓶 ,将玻璃瓶放入微波炉内搞活加热30 秒,取出轻柔摇荡,再次加热 30 秒,重复操作直至琼脂彻底溶解(无颗粒物、悬浮物、透光均一，无明显异常折光，无气泡) 4)将溶解的Seakem Gold agarose放入 56（55-60均可）水浴箱内至少15 分钟，再加入预热到56的 10%SDS 溶液 2.5ml, 置于 56水浴箱备用 . 3、 在 Falcon2054 管(或其他相当的管)上标记样品名称和空白对照;在 1.5ml 微量离心管上标记好对应样品的名称
3、. 4、 在 Falcon2054 管中分别加入约2ml 细胞悬浊液CSB(配方见附件 ). 注:使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB 的量也不同 . 5、 用 CSB 湿润棉签，从培养皿上刮去适量细菌，均与悬浊于CSB 中。通过加入CSB 稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。1） 用比浊仪（ bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度 ,并调整浓度至4.0-4.5 麦氏单位 . 2） 用分光光度计时,在 610nm 波长吸光度应在1.3-1.4. 3） Dade Microscan Turbidity Meter: 0.48-0.52(以 Falcon
4、2054 管测量 ) 0.68-0.72( 以 Falcon2057 管测量 ) 注:在 4.0-4.5 该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果,但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异,影响条带的识别. 6、 取 400ul 细菌悬浊液于相应的1.5ml 微量离心管中,置于 37水浴中孵育5 分钟. 将剩余的细菌悬浊液置于冰上知道胶块制备完毕. 7、 从水浴箱中取出微量离心管,没管加入 20ul 蛋白酶 K( 储存液浓度20mg/ml) 混匀 ,使其终浓度为 0.5 mg/ml, 蛋白酶 K 置于冰上备用. 8、 加入 400ul 的 1%Seakem Gold:1%SDS到上述装
5、有400ul 细菌悬液的微量离心管内,用枪头轻轻混匀 ,避免有气泡产生.(此时 1%Seakem Gold:1%SDS 需置于 56水浴中 ) 9、 迅速将混合物加入模具,避免气泡产生 ,在室温下凝固10-15 分钟 .为节省时间也可以在4下凝固 5 分钟.10、记录好模具内对应样品的名称。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - - 步骤 2 细菌的裂解1、 在 50ml 离心管上做好样品标记. 注:相同菌株的胶条可以同时放
6、于同一个管中裂解,最多不要超过4 条. 2、 配置细胞裂解液CLB（配方见附件） ，然后向每 5ml 细胞裂解液中加入25ul 蛋白酶 K(20 mg/ml), 使其终浓度为0.1 mg/ml, 随后颠倒混匀 . 注:蛋白酶 K 要置于冰上 ,配制好的蛋白酶K/CLB 混合液也要置于冰上.建议配制总量后进行分装 . 3、 每个离心管加入5ml 蛋白酶 K/CLB 混合液 . 4、 如果想使胶块平齐,可以用刀片削去模具表面多余的部分.打开可重复利用模具,用小铲将胶块推入上述裂解混合液中.保证胶块在页面下,而不在管壁上. 注:剩余的菌液以及其它使用过的器具应丢弃并消毒.可重复利用模具需要浸于泡腾片
7、消毒液中 15 分钟 ,然后清洗干净. 5、 将离心管放在54水浴摇床中孵育2 小时，转速约130 转/ 分钟。确认水浴箱内液面高于离心管内裂解混合液的液面。 6、 将纯水和TE 放在 50水浴箱中预热。步骤 3 清洗胶块1、 调低水浴摇床的温度至50。 2、 从水浴摇床中拿出装有胶条的离心管，盖上滤盖，轻轻倒掉CLB ，在试验台上轻磕管底使胶块落在管底。注：可将离心管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排净。随后的操作中也如此。3、 每管中加入10ml 预热的 TYPE ONE WATER. 确保胶块在液面下不在管壁或盖子上. 注: TYPE ONE WATER. 是水质达到18.2M 欧的纯水
8、经高压灭菌后得到的,清洗胶块以及配置TE 缓冲液时均需使用TYPE ONE WATER. 4、 放回 50水浴摇床中，转速约130 转/ 分钟 , 摇 10 分钟 . 5、 倒掉水 ,用 TYPE ONE WATER 再洗一次 . 6、 倒掉水 ,加入 10ml 预热的 TE,在 50水浴摇床中摇15 分钟.7、 倒掉 TE,用 TE重复洗三次 , 每次 10-15 分钟.8、 倒掉 TE,加入 10mlTE, 放在 4冰箱保存备用.注:要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上. 第二天步骤 4 胶块内 DNA 酶切1、 在 1.5ml 离心管上标记好相应的样品及H9812 的名称 . 注: H9
9、812 为国际标准株(沙门氏菌一种),其 XbaI 酶切片段可用于分子量标准2、 按照下面的比列配制缓冲液M 的缓冲体系，并混匀。试剂 ul/胶块 ul/11胶块纯水 160ul 1760ul Buffer M 20ul 220ul BSA 20ul 220ul 总体积 200ul 2200ul 注:其它菌株的配方有所不同;缓冲液要置于冰上,不同试剂供应商,相同试剂供应商的不同酶名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - - 切
10、缓冲液是不通用的,所以应根据产品说明来配制缓冲液体系,这里以 TAKARA为例 . 3、 在每个 1.5ml 微量离心管中加入200ul 缓冲液 . 4、 小心地从TE 中取出胶块放在干净的培养皿上. 5、 用刀片切下约2mm 宽的胶块放入1.5ml 微量离心管中.确保胶块在液面下面,将剩余的胶块放回原来的TE 中. 6、 将试管放在37水浴中孵育10-15 分钟.7、 在用稀释缓冲液孵育的过程中, 按照以下比列配制酶切反应体系, 混匀.试剂 ul/胶块 ul/11胶块纯水 157ul1727ulBuffer M 20ul220ulBSA 20ul220ul酶(15U/ul) 3ul33ul总
11、体积 200ul2200ul注:将酶置于冰上 ,用后立即放在-20保存 . 8、 用枪头吸出缓冲液M ，避免损伤胶块。 9、 每管加入200ul 混合液 ,轻轻在实验台上磕管子的底部,确保胶块在液面的下面. 10、在 37水浴中孵育至少2 小时。 步骤 5 加样1、 打开水浴箱，温度调至55-60. 2、 配制 2200ml 的 0.5 TBE. 3、 用 0.5 TBE 配制 1%Seakem Gold(SKG) 胶. 14cm 宽电泳胶框 (10-15 加样孔 ):1.0 gSKG 胶溶于 100ml 0.5 TBE 中; 21cm 宽电泳胶框 (15 加样孔 ):1.5g SKG 胶溶于
12、 150ml 0.5 TBE 中. 4、 熔化时， 微波加热 60 秒，混合；每隔 15-30 秒重复一次， 直到胶完全熔化。 放在 55-60水浴箱备用（温度至少平衡30 分钟以后使用） 。 5、 调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底部相接触，用水平仪调整胶槽使其水平。6、 从 37水域中取出胶块，平衡到室温。7、 用枪头吸出酶切缓冲液，避免损伤或吸出胶块。8、 每管中加入200ul 0.5 TBE, 室温平衡3 分钟 . 9、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。把标准菌株H9812 上样在第1、5、10 个齿上（ 10 齿梳子）或第1、5、10、15 个齿上（ 15 齿梳子）。10、用吸
13、水纸的边缘吸取胶块附近多余的液体，在室温下风干约3 分钟。11、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底部相接触。从胶槽的下部中央缓慢倒入100ml 融化的在 55-60平衡的 1%SKG. 避免气泡的产生 ; 如果有 , 用枪头消除. 在室温下凝固30 分钟. 12、记录加样顺序。 步骤 6 电泳 1、 确保电泳槽是水平的，如果不水平，调整槽底部的旋钮。（注：不要触碰电极） 2、 加入 2 2.2L0.5 TBE，盖上盖子。3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在70（这时缓冲液的流速约1L/分钟）和缓冲液在管道名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - -
14、 - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - - 中正常循环 .4、 打开冷凝机 ,确保预设温度在14 ( 缓冲液达到该温度通常约需要20 分钟)5、 打开胶槽的旋钮, 取出凝固好的胶, 用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶, 小心的把胶放入电泳槽 , 关上盖子.6、 设置电泳参数.1)沙门菌属以XbaI 或 AvrII(BlnI)酶切 ,电泳条件相同 .CHEFMapper:Auto Algorithm30Kblow MW(最小分子量 )700Kbhigh MW( 最大分子量 )按”enter
15、”选择程度默认值Runtime( 电泳时间 )改为 18 19h(默认值 :initial switch time(初始转换时间)=2.16s;Final switch time( 终止转换时间)=63.8s)CHEFDRIII:initial switch time(初始转换时间)=2.2sFinal switch time( 终止转换时间 )=63.8sVoltage:6VIncluded Angle:120Runtime( 电泳时间 )改为 18 19h2)大肠杆菌 0157 和宋内志贺菌XbaI 或 AvrII(BlnI)酶切 ,电泳条件相同CHEFMapper:Auto Algori
16、thm30Kblow MW(最小分子量 )600Kbhigh MW( 最大分子量 )按”enter ”选择程度默认值Run time( 电泳时间 )改为 18 19h(默认值 :initial switch time(初始转换时间 )=2.16s;Final switch time(终止转换时间 )=54.17s)CHEFDRIII:initial switch time(初始转换时间 )=2.2sFinalswitch time( 终止转换时间)=54.2sVoltage:6VIncluded Angle:120Run time( 电泳时间 )改为 18 19h3)非 0157 产志贺毒素大
17、肠杆菌XbaI 或 AvrII(BlnI)酶切 ,电泳条件相同.CHEFMapper:Auto Algorithm30Kblow MW(最小分子量 )400Kbhigh MW( 最大分子量 )名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 5 页 - - - - - - - - - 按”enter ”选择程度默认值Run time( 电泳时间 )改为 18 19h(默认值 :initial switch time(初始转换时间 )=6.76s;Final switch t
18、ime(终止转换时间 )=35.38s)CHEFDRIII:initial switch time(初始转换时间 )=6.76sFinal switch time( 终止转换时间)=35.38sVoltage:6VIncluded Angle:120Run time( 电泳时间 )改为 18 19h7、 记录电泳初始电流（通常110 170mA）注:以上所推荐电泳时间是以CDC仪器和试剂确定的.在不同实验室,电泳时间可能不同;调整电泳时间 ,使电泳胶中H9812 最小片段距胶底端1.0 1.5cm.第三天步骤 7 图像的获取及分析1、结束电泳 ,关机顺序为 :冷凝机 泵 主机 .2、取出胶 ,
19、放在盛放400mlEB 溶液的托盘内 .注:EB储存液浓度为10mg/ml,1:100000 稀释 ,即在 400ml 水中加入 40ul 储存液 ,EB是强致畸剂 .储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用10 次左右 .废弃的 EB溶液应妥善处理.可选用毒性小的GelRed染剂做代替 .3、将托盘放在摇床上摇25 30 分钟 .4、放掉电泳槽中的TBE, 用 2L 纯水清洗电泳槽,并倒掉液体 .5、带上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中,在托盘中加入400 500ml 纯水 ,放在摇床上脱色60 90 分钟 ,如可能每20 30 分钟换一次纯水.6、用 GelDocXR+拍摄图像 .注:如果背景干扰分析,可进一步脱色30 60 分钟 ,或者静止过夜脱色.7、转换成 *.lsc 文件为 *.tiff 文件用于处理分析,用于 BioNumerics 软件分析 .名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 5 页 - - - - - - - - -