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1、实验目的实验目的1.使用专一的培养基（含有尿素）分离专一的细菌。 （如有脲酶的细菌）2.利用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。一、实验原理一、实验原理尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的某类细菌能够合成脲酶将尿素分解成氨，之后被植物利用。(NH2)2C=O + H2O脲酶脲酶+ CO2NH3思考：怎么从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物呢？利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选。一、实验原理一、实验原理氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出
2、分解尿素的微生物。利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选。一、实验原理一、实验原理(NH2)2C=O + H2O脲酶脲酶+ CO2NH3思考：如何检验细菌产生脲酶水解尿素？ 尿素尿素 NH3 中性中性 碱性碱性 酚红指示剂：酚红指示剂： (酸性)黄色黄色 红色红色1.1.在在100ml100ml烧杯中装入烧杯中装入50ml70%50ml70%酒精；酒精；2.2.配制配制25mL LB 25mL LB 全营养固体培养基；全营养固体培养基；3.3.配制配制25mL 25mL 尿素固体培养基；尿素固体培养基；4.4.将盛有将盛有4.5ml4.5ml蒸馏水的蒸馏水的5 5支有塞试管；支有塞试管；5.5.
3、在在250ml250ml三角瓶中装入三角瓶中装入99ml99ml蒸馏水；蒸馏水；6.6.土样土样1g1g。二、实验器材二、实验器材三、实验步骤三、实验步骤1 1、制备无菌的、制备无菌的LBLB固体培养基和尿素固体培养基固体培养基和尿素固体培养基 LBLB固体固体培养基培养基 NaCl NaCl 0.25g 0.25g 蛋白胨蛋白胨 0.25g0.25g 酵母提取液酵母提取液 0.12g0.12g 水水 25mL25mL 琼脂糖琼脂糖 0.5g0.5g 全营养培养基全营养培养基 尿素固体培养基尿素固体培养基 NaCl NaCl 0.12g0.12g K K2 2HPOHPO4 4 0.12g0.
4、12g 葡萄糖葡萄糖 0.025g0.025g 水水 15mL15mL 琼脂糖琼脂糖 0.5g0.5g 酚红酚红 0.25mg0.25mg选择培养基选择培养基三角瓶中配制，加封口膜灭菌尿素 10mL三角瓶中配制，加封口膜灭菌G6玻璃砂漏斗三、实验步骤三、实验步骤2 2、倒平板：、倒平板：思考：倒平板的具体操作是什么？在60左右时，将三角瓶中已经灭菌的LB全营养培养基和尿素培养基，在酒精灯火焰旁分别倒在两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。3 3、制备细菌悬液、制备细菌悬液三、实验步骤三、实验步骤在无菌条件下，将1g土样加到有99mL无菌水的三角瓶中，震荡10min，即成10-2土壤稀
5、释液。依此法制备10-3、10-4和10-5土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液。摇匀，放在试管架上。 4 4、用涂布法分离细菌用涂布法分离细菌三、实验步骤三、实验步骤取10-5和10-4的土壤稀释液各0.1mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中。再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。枪头移液器（移液枪）玻璃刮刀（涂布器）5 5、培养培养三、实验步骤三、实验步骤将培养皿倒置，在37恒温培养箱中培养2448小时，观察菌落数。6 6、观察观察全营养培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的培养基中只有少量菌落。LBLB
6、培养基培养基稀释度稀释度1010-6 -6LBLB培养基培养基稀释度稀释度1010-7 -7尿素培养基尿素培养基稀释度稀释度1010-4 -4尿素培养基尿素培养基稀释度稀释度1010-5 -5按浓度捆成一摞按浓度捆成一摞恒温恒温37培养培养10-5 、 10-4,、 在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 分分析与讨论：析与讨论：1.为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？2.有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，如果用琼脂固定培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿
7、素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。如土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，与其他阴离子形成化合物会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用所形成的氨，有利于自然界的氮循环。3.有脲酶细菌菌落周围为什么有红色环带？4.与全营养培养基上的菌落数比较，为什么 尿素培养基上只有少数菌落？能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量。分分析与讨论：析与讨论：红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。 细菌分泌脲酶，使培养基中尿素水解，并产生氨NH3（碱性）。而酚红在酸
8、性环境里呈黄色，碱性里呈红色。所以培养基中酸碱指示剂变红，标志着存在尿素被水解成氨的现象，从而证明这一菌株以尿素为氮源。实践训练实践训练2016年10月选考题取适量含产脲酶细菌的10-4，10-5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48小时，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是 。A10-5稀释液+尿素固体培养基 B10-5稀释液+LB固体培养基 C10-4稀释液+尿素固体培养基 D10-4稀释液+LB固体培养基在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现 ，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生 所致。A红色环带1.使用选择培养基的目的是（ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要碳源和氮源分别是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素CD实践训练实践训练