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1、实验分离以尿素为氮源的微生物实验分离以尿素为氮源的微生物脲，又称尿素，脲，又称尿素，CNH2NH2O 是蛋白质的降解产物，会污染环境，是蛋白质的降解产物，会污染环境，但可以被含脲酶的微生物分解。但可以被含脲酶的微生物分解。第1页/共20页 实验原理：含有脲酶的细菌可以从尿素中得到源，而其含有脲酶的细菌可以从尿素中得到源，而其他细菌不能得到源，因此可以用以尿素为唯一他细菌不能得到源，因此可以用以尿素为唯一源的培养基选择出这些微生物。源的培养基选择出这些微生物。尿素在脲酶的降解下产生，使培养基的变尿素在脲酶的降解下产生，使培养基的变为碱性，酚红遇碱由红黄色变成红色，因此为碱性，酚红遇碱由红黄色变成
2、红色，因此可以用酚红鉴定。可以用酚红鉴定。(NH2)2C=O+H2O 2NH3+CO2脲酶脲酶第2页/共20页选择培养基选择培养基全营养培养基全营养培养基尿素为唯一氮尿素为唯一氮源的培养基源的培养基土壤稀释液土壤稀释液（多种微生物）（多种微生物）结果如何？结果如何？第3页/共20页设备及用品：设备及用品：设备及用品：设备及用品：实验材料：实验材料：实验材料：实验材料：()()全营养固体培养基：蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖、全营养固体培养基：蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖、全营养固体培养基：蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖、全营养固体培养基：蛋白胨、酵母提取物、琼脂糖、加水。加水。加水。加水。()()尿素固
3、体培养基：葡萄糖、尿素固体培养基：葡萄糖、尿素固体培养基：葡萄糖、尿素固体培养基：葡萄糖、酚红、琼脂糖、加水。、酚红、琼脂糖、加水。、酚红、琼脂糖、加水。、酚红、琼脂糖、加水。灭菌冷却到灭菌冷却到灭菌冷却到灭菌冷却到时加入经玻璃漏斗过滤（使其无菌）的时加入经玻璃漏斗过滤（使其无菌）的时加入经玻璃漏斗过滤（使其无菌）的时加入经玻璃漏斗过滤（使其无菌）的尿素溶液（内含脲）。尿素溶液（内含脲）。尿素溶液（内含脲）。尿素溶液（内含脲）。）土样。）土样。）土样。）土样。.酚红的作用是什么？酚红的作用是什么？.凝固剂为什么使用琼脂糖，而不是琼脂？凝固剂为什么使用琼脂糖，而不是琼脂？.能否连同尿素一起进行灭
4、菌？如何操作？能否连同尿素一起进行灭菌？如何操作？琼脂是未被纯化的混合物，琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物内含一定量的含氮化合物第4页/共20页实验步骤：实验步骤：观观察察注意：尿素经过玻璃漏斗过注意：尿素经过玻璃漏斗过滤后加入滤后加入培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌倒平板倒平板接种接种全营养固体培养基（对照组）全营养固体培养基（对照组）尿素固体培养基（实验组）尿素固体培养基（实验组）玻璃刮刀、玻璃刮刀、涂布分离涂布分离培养培养对照组：对照组：实验组：实验组：制备细菌悬液制备细菌悬液倒置，倒置，恒温培养箱，左右恒温培养箱，左右菌落数量和种类多而杂菌落数量和种类多而杂菌落少、单
5、一，菌落周围出现菌落少、单一，菌落周围出现红色区域红色区域第5页/共20页 制备细菌悬液：制备细菌悬液：的无菌水的无菌水的无菌水的无菌水土壤土壤第6页/共20页4.5ml无菌水无菌水0.5ml0.5ml0.5ml土样土样无菌水无菌水第7页/共20页第9页/共20页培养基上培养基上、稀、稀释液涂布结果释液涂布结果尿素培养基上尿素培养基上、稀释液涂布结、稀释液涂布结果果恒温培养恒温培养第10页/共20页注意事项注意事项为使结果接近真实值可将同一稀释为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。涂布，培养计算出菌落平均数。涂
6、布平板法所选择的稀释度很重要，涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般取三个稀释度一般取三个稀释度同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。大，表明试验不精确，需要重新实验。大，表明试验不精确，需要重新实验。大，表明试验不精确，需要重新实验。第11页/共20页微生物的培养与观察微生物的培养与观察微生物的培养与观察微生物的培养与观察第12页/共20页稀释涂布平板法可用于测定活菌数：稀释涂布平板法可用于测定活菌数：稀释涂布平板法可用于测定活菌数：稀释涂布平板法可用于测
7、定活菌数：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数()()()()其中，代表某一稀释度下平板上生长其中，代表某一稀释度下平板上生长其中，代表某一稀释度下平板上生长其中，代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，代表涂布平板时所用的平均菌落数，代表涂布平板时所用的平均菌落数，代表涂布平板时所用的平均菌落数，代表涂布平板时所用的稀释液的体积的稀释液的体积的稀释液的体积的稀释液的体积()()()()，代表稀释倍数。，代表稀释倍数。，代表稀释倍数。，代表稀释倍数。例如例如 若某同学将毫升的菌液稀释成倍，若某同学将毫升的菌液稀释成倍，涂布分离后，个平板的菌数依次为：个，涂布
8、分离后，个平板的菌数依次为：个，个，个。请问，你能算出该试管中的细菌数大个，个。请问，你能算出该试管中的细菌数大约是多少吗？约是多少吗？第13页/共20页实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，同学从对应的倍稀释的培养基数目的实验时，同学从对应的倍稀释的培养基数目的实验时，同学从对应的倍稀释的培养基数目的实验时，同学从对应的倍稀释的培养基中筛选出大约个菌落，但是其他同学在同样的中筛选出大约个菌落，但是其他同学在同样的中筛选出大约个菌落，但是其他同学在同样的中筛选
9、出大约个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约个菌落。分析其原因。稀释度下只选择出大约个菌落。分析其原因。稀释度下只选择出大约个菌落。分析其原因。稀释度下只选择出大约个菌落。分析其原因。原原原原因因因因：土土土土样样样样不不不不同同同同，培培培培养养养养基基基基污污污污染染染染或或或或操操操操作作作作失失失失误误误误(或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)第14页/共20页第15页/共20页第16页/共20页小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验
10、结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与同学相同土样进行实验方案一：由其他同学用与同学相同土样进行实验方案一：由其他同学用与同学相同土样进行实验方案一：由其他同学用与同学相同土样进行实验 方案二：将同学配制的培养基在不加土样的情况方案二：将同学配制的培养基在不加土样的情况方案二：将同学配制的培养基在不加土样的情况方案二：将同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否下
11、进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。受到污染。受到污染。受到污染。结果预测：如果结果与同学一致，则证明无误；结果预测：如果结果与同学一致，则证明无误；结果预测：如果结果与同学一致，则证明无误；结果预测：如果结果与同学一致，则证明无误；如果结果不同，则证明同学存在操作失误或培养如果结果不同，则证明同学存在操作失误或培养如果结果不同，则证明同学存在操作失误或培养如果结果不同，则证明同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。基的配制有问题。基的配制有问题。第18页/共20页颜色：颜色：预期：预期：酚红由酚红由黄黄变变红红。说明有分解尿素的细菌存在，且随着。说明有分解尿素的细菌存在，且随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。中性中性碱性碱性细菌细菌黄色黄色 红色红色酚红：酸碱指示剂，酚红：酸碱指示剂，变色范围变色范围：pH6.48.2第19页/共20页