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1、会计学1实验实验 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物任务任务1：怎么从土壤中分离出能分解尿：怎么从土壤中分离出能分解尿素并将其作为氮源的微生物呢？素并将其作为氮源的微生物呢？利用以尿素为唯一氮源利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选。的培养基进行筛选。第1页/共25页配制培养配制培养基基n n尿素培养基尿素培养基尿素培养基尿素培养基25ml25ml 葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖 0.025g0.025g NaCl 0.12g NaCl 0.12g K K2 2HPOHPO4 4 0.12g 0.12g水水水水 15ml15ml 尿素尿素尿素尿素 10ml10ml 功能上是选功能上是选功
2、能上是选功能上是选择培养基择培养基择培养基择培养基物理性质（形态）物理性质（形态）物理性质（形态）物理性质（形态）上是固体培养基上是固体培养基上是固体培养基上是固体培养基选择培养基：选择培养基：选择培养基：选择培养基：在在在在微生物学中，将微生物学中，将微生物学中，将微生物学中，将允许允许允许允许特定特定特定特定种类的种类的种类的种类的微生物生长，同微生物生长，同微生物生长，同微生物生长，同时时时时抑制和阻止其抑制和阻止其抑制和阻止其抑制和阻止其他他他他种类微生物生种类微生物生种类微生物生种类微生物生长的培养基，称长的培养基，称长的培养基，称长的培养基，称作选择培养基。作选择培养基。作选择培养
3、基。作选择培养基。第2页/共25页（1 1）将土壤中的固氮菌分离出来）将土壤中的固氮菌分离出来（2 2）将土壤中自养微生物分离出来）将土壤中自养微生物分离出来举一反三举一反三（3 3）筛选出抗青霉素的微生物）筛选出抗青霉素的微生物（4 4）筛选出耐高浓度食盐的微生物）筛选出耐高浓度食盐的微生物第3页/共25页配制培养配制培养基基n n尿素培养基尿素培养基25ml 葡萄糖葡萄糖 0.025g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 水水 15ml 尿素尿素 10ml 琼脂糖琼脂糖 0.5g琼脂琼脂琼脂琼脂是未被纯化的是未被纯化的是未被纯化的是未被纯化的混合物混合物混合物混合物,内含一定内
4、含一定内含一定内含一定量的含氮化合物量的含氮化合物量的含氮化合物量的含氮化合物琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖不含氮元素，不含氮元素，不含氮元素，不含氮元素，但有固化作用。但有固化作用。但有固化作用。但有固化作用。第4页/共25页1 1、通过什么方法可以判断细菌确实能、通过什么方法可以判断细菌确实能将尿素分解成氨。将尿素分解成氨。思考：思考：方法：在方法：在以尿素作为唯一氮源以尿素作为唯一氮源的培养的培养基中加入基中加入酚红酚红指示剂指示剂,接种培养该接种培养该细菌，若指示剂细菌，若指示剂变红变红，说明该种菌，说明该种菌能将尿素分解成氨。能将尿素分解成氨。尿素培养基尿素培养基n n葡萄糖葡萄糖 0.0
5、25gn nNaCl 0.12gn nK2HPO4 0.12g n n琼脂糖琼脂糖 0.5gn n酚红酚红 0.25gn n尿素尿素 10mln n水水 15ml第5页/共25页2 2、要验证以尿素为唯一氮源的培养基、要验证以尿素为唯一氮源的培养基对土壤中的细菌确实具有选择作用，你对土壤中的细菌确实具有选择作用，你该如何设计实验。该如何设计实验。思考：思考：第7页/共25页配制培养基配制培养基n n尿素培养基尿素培养基 葡萄糖葡萄糖 0.025g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 琼脂糖琼脂糖 0.5g 酚红酚红 0.25g 尿素尿素 10ml LBLB培养基培养基培养基培养基
6、蛋白胨：蛋白胨：蛋白胨：蛋白胨：0.25g0.25g 酵母粉：酵母粉：酵母粉：酵母粉：0.12g0.12g NaCl NaCl：0.25g0.25g 琼脂糖：琼脂糖：琼脂糖：琼脂糖：0.5g 0.5g 对照组对照组对照组对照组选择培养选择培养选择培养选择培养基基基基实验组实验组实验组实验组第8页/共25页二、实验目的二、实验目的:使用以尿素为使用以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基分离细菌分离细菌(有脲酶有脲酶)通过指示剂（酚红）通过指示剂（酚红）颜色的变化颜色的变化检知检知培养基培养基pHpH的变化的变化(脲酶催化的脲酶催化的化学反应化学反应)统计被检测的土壤中含有的以尿统计被检测的土壤
7、中含有的以尿素为氮源的微生物的数量素为氮源的微生物的数量第9页/共25页三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多（一）哪些土壤中含有这种以尿素为氮源的微生物多？（选材的问题）？（选材的问题）？（选材的问题）？（选材的问题）（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？（二）此实验用到的选择培养基必需含有哪些物质？（二）此实验用到的选择培养基必
8、需含有哪些物质？（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物（三）可用什么指标认定不同土壤中选择出的微生物对尿素分解能力的高低？对尿素分解能力的高低？对尿素分解能力的高低？对尿素分解能力的高低？（四）统计微生物的数量可用哪些方法？（四）统计微生物的数量可用哪些方法？（四）统计微生物的数量可用哪些方法？（四）统计微生物的数量可用哪些方法？没硬化，腐殖质丰富的土壤没硬化，腐殖质丰富的土壤没硬化，腐殖质丰富的土壤没硬化，腐殖质丰富的土壤碳源、尿素、无机盐、水、酚红碳源、尿素、无机盐、水、酚红碳源、尿素、无机
9、盐、水、酚红碳源、尿素、无机盐、水、酚红培养基红色的深浅和区域的大小培养基红色的深浅和区域的大小培养基红色的深浅和区域的大小培养基红色的深浅和区域的大小稀释涂布平板法，显微镜直接计数法稀释涂布平板法，显微镜直接计数法稀释涂布平板法，显微镜直接计数法稀释涂布平板法，显微镜直接计数法第10页/共25页三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：三、实验中涉及到的一些问题：（五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在（五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在（五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在（五）用稀释涂布平板法计数时，菌落数在30-30030-30030-3003
10、0-300计数。计数。计数。计数。重复性原则重复性原则重复性原则重复性原则对照原则对照原则对照原则对照原则（排除实验组中非测试因素对实验结果的（排除实验组中非测试因素对实验结果的（排除实验组中非测试因素对实验结果的（排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验的可信度）影响，提高实验的可信度）影响，提高实验的可信度）影响，提高实验的可信度）做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度做一系列浓度梯度实验，探究合适的稀释度（六）实验设计要遵循的原则：（六）实验设计要遵循的原则：（六）实验设计要遵循的原则：（六）实验设计要遵
11、循的原则：第11页/共25页 过滤灭菌后过滤灭菌后的尿素的尿素第12页/共25页（二）制备细菌悬液（二）制备细菌悬液制备成制备成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀释液土壤稀释液第13页/共25页配制菌悬液配制菌悬液1 1个个个个99ml99ml无菌水无菌水无菌水无菌水 2 2个个个个4.5ml4.5ml无菌水无菌水无菌水无菌水得得得得1010-2-2,10,10-3-3,10,10-4-4的菌悬液的菌悬液的菌悬液的菌悬液1g1g土壤土壤土壤土壤第14页/共25页倒平板倒平板n n需要倒需要倒需要倒需要倒3 3个个个个LBLB平板，平板，平板，平板，9 9个尿素平板个尿素平板个尿素平板
12、个尿素平板LB(LB(对照对照对照对照)尿素尿素尿素尿素1010-3-31010-4-41010-5-5每个稀释度每个稀释度每个稀释度每个稀释度 1 1个个个个LBLB对照平板对照平板对照平板对照平板 3 3个尿素平板个尿素平板个尿素平板个尿素平板(平行重复组平行重复组平行重复组平行重复组)第15页/共25页接种接种n n取0.1ml菌悬液第16页/共25页涂布分离涂布分离第17页/共25页涂布分离涂布分离第18页/共25页第19页/共25页37倒置培养倒置培养按浓度捆成一摞按浓度捆成一摞恒温恒温37培养培养第20页/共25页10-4、10-3,、10-2第21页/共25页利用血球计数板的缺点
13、利用血球计数板的缺点利用血球计数板的缺点利用血球计数板的缺点:不能区分死菌与活菌不能区分死菌与活菌不能区分死菌与活菌不能区分死菌与活菌不适于对运动的细菌计数不适于对运动的细菌计数不适于对运动的细菌计数不适于对运动的细菌计数需要相对高的细菌浓度需要相对高的细菌浓度需要相对高的细菌浓度需要相对高的细菌浓度个体小的细菌在显微镜底下难以观察个体小的细菌在显微镜底下难以观察个体小的细菌在显微镜底下难以观察个体小的细菌在显微镜底下难以观察第22页/共25页练习题练习题1 1、选择培养基：在微生物学中，将允许、选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物种类的微生物生长，同时生长，同时 和和 其他种类微生
14、物生长的培养基，称作其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。选择培养基。阻止阻止 特定特定抑制抑制2 2、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品、常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在一般选择菌落数在 的平板进行计数。此外，测定的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还
15、有微生物数量的常用方法还有 直接计数。直接计数。显微镜显微镜 稀释度稀释度细菌细菌30-30030-3003 3、在同一稀释度下，至少对、在同一稀释度下，至少对3 3个平板进行重复计数，然后个平板进行重复计数，然后求出求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。细菌的数目。平均数平均数 第23页/共25页4 4、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀、用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为释倍数为10106 6的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是的培养基中得到以下几种统计结果，正确的是 A A涂布了一个平
16、板，统计的菌落数是涂布了一个平板，统计的菌落数是230230 B B涂布了两个平板，统计的菌落数是涂布了两个平板，统计的菌落数是215215和和260260，取平均值，取平均值238238 C C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2121、212212和和256256，取，取平均值平均值163163 D D涂布了三个平板，统计的菌落数分别是涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l02l0、240240和和250250，取，取平均值平均值233233D 5.5.在做分离分解尿素的细菌实验时，在做分离分解尿素的细菌实验时，A A同学从对应同学从对应10106 6培养基上培养基上筛选出大约筛选出大约150150个菌落，而其他同学只选择出大约个菌落，而其他同学只选择出大约5050个菌落。个菌落。A A同学的结果产生原因可能有同学的结果产生原因可能有()()由于土样不同由于土样不同 由于培养基污染由于培养基污染 由于操作失误由于操作失误 没有设置对照没有设置对照 A A B B C C D DA 第24页/共25页