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1、读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思生化制备概论一 制备主要对象及特点蛋白质：易降解易变性多样性多种因素影响活性核酸：分子量大，易被机械切割力破坏（基因组DNA）易降解（酶解）特别是RNA 常与核蛋白质结合多糖：成分复杂多样，分析困难，糖苷同样也会被多种酶降解脂类：种类多，成分复杂，分析仪器要求较高二 物质的提取与缓冲溶液针对蛋白质的操作一般要注意的问题：基本原则：防止生物分子变性、降解1控制适当的pH2控制低温3注意提取过程中的溶液环境4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基1 低温04 度。2 缓冲溶液提取操作，适度的离子(盐)浓度。3 加保护剂酶抑制剂，如巯基乙醇、DTT, ，Vc,PV
2、P ,重金属络合剂，酶的底物蛋白酶抑制剂等等4 操作连续，尽量快速。5 避免剧烈搅拌。蛋白质的溶液提取（抽提）水溶液提取：大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，是提取蛋白质的最常用溶剂。盐浓度等渗 盐溶液尤以0.020.05mol/L 磷酸盐 缓冲液和 碳酸盐 缓冲液常用。0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如脱氧核糖核蛋
3、白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取PH 值：蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果细胞破粹方法： 1、 高速组织捣碎： 将材料剪小， 放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细
4、胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料， 用大肠杆菌制备各种酶，常选用 50-100 毫克菌体 /毫升浓度，在 1KG至 10KG频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感物质和核酸应慎用。4、反复冻融法：将细胞在 -20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。5、化学处理法 ：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（S
5、DS ） 、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。6 渗透冲击 ：用蒸馏水冲击细胞或经过高渗液处理（平衡）过的细胞，让细胞内容物释放出来无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP ）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入对苯甲基磺酰氟（ PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部。表面活性剂的利用：对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯
6、磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等） 及非离子型 （Triton X-100 、 NP-40 等 ） 、两性离子去污剂CHAPS 、OBG等。其中 CHAPS和 SB3-10最好。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。膜蛋白提取注意事项常用去垢剂： SDS Tween 20 40 Triton X-100 CHAPS 三 蛋白质的基本操作盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一
7、般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶； 当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析分段盐析，有机溶液沉淀目的纯化浓缩保存注意事项影响盐析的因素有： （1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4 度）操作外，一般可在室温中进行。 一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质 （如血红蛋白、 肌红蛋白、 清蛋白）在较高的温度（25 度）比 0 度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。（3）蛋白质浓度： 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。 因此在盐析前血清要加等
8、量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0% 。应用最多的 硫酸铵 ，它的优点是温度系数小而溶解度大（25 度时饱和溶液为4.1M ， 即 767克/升； 0 度时饱和溶解度为3.9M，即 676 克/升） ，在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之间，当用其他pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思样品保存溶液状态冷藏保、冷冻保存、
9、液氮保存干粉状态真空干燥、喷雾干燥、冰冻干燥、脱脂样品、丙酮干粉蛋白质含量的测定变性不溶解蛋白质凯氏定氮法“ 可溶”蛋白质（蛋白质溶液）1 双缩脲法 （Biuret assay ）2 劳里反应 （Lowry assay ）Folin-酚法3 巴福得测定法（Bradford assay ）标准曲线4 UV(紫外分光光度 )法Absorbance assaysAbsorbance at 280 nmRange: 20 micrograms to 3 mg Volume: Depends on cuvette - volumes range from 200 microliters to 3 ml
10、or greater Accuracy: Fair Convenience: Excellent, if equipment available Major interfering agents: Detergents, nucleic acids, particulates, lipid droplets Absorbance at 205 nmRange: Roughly 1 to 100 micrograms Volume: Depends on cuvette - volumes range from 200 microliters to 3 ml or greater Accurac
11、y: Fair Convenience: Very good Major interfering agents: Detergents, nucleic acids, particulates, lipid droplets Colorimetric assaysModified LowryRange: 2 to 100 micrograms Volume: 1 ml (scale up for larger cuvettes) Accuracy: Good 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐
12、进 ,熟读而精思Convenience: Fair Major interfering agents: Strong acids, ammonium sulfate BiuretRange: 1 to 10 mg Volume: 5 ml (scale down for smaller cuvettes) Accuracy: Good Convenience: Good Major interfering agents: Ammonium salts Bradford assayRange: 1 to 20 micrograms (micro assay); 20 to 200microgra
13、ms (macro assay) Volume: 1 ml (micro); 5.5 ml (macro) Accuracy: Good Convenience: Excellent Major interfering agents: None 针对核酸的操作一般要注意的问题基本要求： 尽量保持被分离核酸的完整性，除去影响下步操作的物物质。高分子量的DNA（核 DNA） 操作主要注意的是它易被机械切割力破坏RNA操作的主要障碍是“无处不在”的RNA酶的降解STORAGE ： （储存）5oC is one of the best and simplest conditions for stori
14、ng DNA. -20oC: this temperature causes extensive single and double strand breaks. -70oC is probable excellent for long-term storage. For long-term storage of DNA, it is best to store in high salt (1M) in the presence of high EDTA (10mM) at pH 8.5 . Storage of DNA in buoyant CsCl with ethidium bromid
15、e in the dark at 5oC is excellent. There is about one phosphodiester break per 200 kb of DNA per year. Storage of DNA in the phage is better than storing the pure DNA . QUANTITATION. （定量）. For pure solutions of DNA, the simplest method of quantitation is reading the absorbance at 260 nm where an OD
16、of 1 in a 1 cm path length = 50 ug/ml for double-stranded DNA, 40 ug/ml for single-stranded DNA and RNA and 20-33 ug/ml for oligonucleotides. An absorbance ratio of 260 nm and 280 nm gives an estimate of the purity of the solution. Pure DNA and RNA solutions have OD260/OD280 values of 1.8 and 2.0, r
17、espectively. This method is not useful for small quantities of DNA or RNA (1 ug/ml). RNA 操作注意事项与实验技巧1.如果可能，实验室应辟出专门RNA 操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。2.操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身，常常造成操作不便，而且多出部分还容易在器具上遭 RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。3.尽量使用一
18、次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。推荐使用出厂前已经灭菌的枪头和离心管，大多国外厂商供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染， 买来后可直接用于RNA 操作。 许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA 酶，从而导致实验失败。4.配制溶液用的酒精，异丙醇、Tris 等应采用未开封的新品。溶液需用DEPC水配制精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思（加 0.01%(体积比 )DEPC至重蒸水或Mili Q 级水中，处理过夜，灭
19、菌即成DEPC水）5.所有玻璃制品都必须在240烘烤 4 小时。 所有旧塑料制品都必须用0.5M 的 NaOH处理 10 分钟，并用DEPC-H2O彻底冲洗后灭菌，也可考虑用0.01%的 DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。无法用DEPC处理的用具可以用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA 酶的活性。样本保存的注意事项：样本一旦从生物体中分离后，细胞内的RNA 就变得非常不稳定，容易降解。因此取样后，如何保证取样前后基因的表达模式不变，就变得非常重要。传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。核酸提取分离纯化的基本操作碱裂解的原理： 碱裂解抽提质粒DNA 是基于染色体DNA 与质粒 DN
20、A 的变性和复性的差异而达到分离目的。在碱性条件下，线性大分子细菌染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构互补链变性解开。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8 的 NaAc 高盐缓冲液调其pH 值至中性，变性的质粒DNA 又恢复到原来的构型，保存在溶液中为可溶状态。而染色体DNA 不能复性，形成缠连的网状结构。通过离心将细胞碎片，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质 -SDS复合物等一起沉淀下来被除去，质粒DNA则存在于上清中。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化
21、和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA 已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。层析(色谱)技术?薄层层析薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板（一般是玻璃板）上，成为薄层，把样品点在薄层上，用适当的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的一种层析技术。（一）原理：如果支持剂不同其层析的原理也不同：如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，层析时主要是依据吸附力的不同进行层析分离，则称之为薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时主要是依据分配系数的不同进行层析分离，则称之为薄层分配层析；如果
22、支持板上铺上离子交换剂，层析主要依据是离子交换作用，则称之为离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，主要依据相对分子质量的大小而分离的则称之为薄层凝胶层析等。这几种薄层层析的原理各不相同，但其操作技术即大同小异。细胞和组织的破粹酶处酚-氯仿抽提乙醇沉淀梯度离心碱变性和复性柱纯化、分级分离电泳及分析核酸的检测和定量分析精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思?薄层层析的优点：1、快速、展层时间短，一般仅需1560 分钟。2、设备简单，操作方便。3、分辨力比纸层析高10100 倍，它既能分
23、离0.01g 的微量样品，又能分离500 甚至更多的样品，也适用于制备。制备可规格化。4、点样后可立即展开，不受温度和溶剂饱和程度的影响，易控制。所以操作时比纸层析少一个“ 平衡 ” 步骤。5、可以使用腐蚀性显色剂（用淀粉做粘合剂的薄板除外）。其缺点是Rf 值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想?薄层板常用的制作方法有：1、浸涂法2、喷涂法3、倾斜涂布法（倾淌法）4、推铺法Applications of TLC ：Identification of unknown compound Qualitative analysis of unknown mixture Determi
24、nation of sample purity Monitor the course of reactions Determine the solvent system that works well for column chromatograpy 各类层析的原理和载体类别分离原理基质或载体吸附层析化学、物理吸附硅胶、氧化铝、羟基磷酸分配层析两溶剂相中的溶解效应纤维素、硅藻土、硅胶凝胶层析分子筛效应的排阻效应sepharose 、sephadex 离子交换层析离子基团的交换反应离子交换树脂、纤维素、葡聚糖亲和层析分离物与配体之间有带配基的sepharose 或特殊亲和力sephadex 聚焦
25、层析等电点和离子交换作用多缓冲交换剂（与带有多种电荷基团的配体相偶联的sepharose 6B）用于蛋白质分离层析的主要分类精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思离子交换层析：容量大，分离效果好，样品体积不受限制，抗污染力强，有浓缩作用的优点。操作过程： 1.交换剂的选择2 交换剂的预处理典型硷洗 -水洗 -酸洗 -水洗-上样缓冲液平衡（装柱后）3 色谱柱的规格样品组成复杂量多时20 30cm 相反 510cm 4 装柱上样上样量一般是理论负载量的1/3 5 洗脱分步（段）洗脱连续
26、梯度洗脱分配层析分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的法。分配系数 是指一种溶质（AA）在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时该溶质在两相溶剂中的浓度比值。在层析条件确定后分配系数是一常数，以K表示。凝胶过滤应用1 脱盐常用 sephadex G25 外水体积测定蓝色葡聚糖2 分组分离（组别分离）短柱3 分级分离生物大分子纯化长柱4 分子量测定电泳技术传统电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）PAGE是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶(PAG)作为支持物，采用电泳基质的不连续体系(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH 的不连续性及电位梯度的不连续性) 或
27、 连续体系（一层凝胶、一种pH 和一种缓冲溶液） ，进行电泳分离一种方法。不连续 PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应SDS-PAGE 当 SDS （Sodium Dodecyl Sulfate）与蛋白质结合后， 蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS -蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下， 样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：Log Mr=a bmr精选学习资料 - - - - -
28、 - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思样品全蛋白组成分析应用 : 测定蛋白质分子量测定蛋白质亚基数精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思电渗精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 14
29、 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思毛细管电色谱（capillary electro chromatography ，CEC ）以内含色谱固定相的毛细管为分离柱，兼具毛细管电泳及高效液相色谱的双重分离机理，既可分离带电物质也可分离中性物质。毛细管电色谱法是用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 14 页读书之法 ,
30、在循序而渐进 ,熟读而精思毛细管电色谱法可以说是HPLC和 HPCE 的有机结合， 它不仅克服了HPLC 中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展，而且柱内无压降， 使峰扩展只与溶质扩散系数有关，从而获得了接近于HPCE 水平的高柱效，同时还具备了HPLC 的选择性。HPLC是用压力驱动流动相。流速是随填充微粒的大小和柱长而变化的。流速在管中呈抛物线轮廓，因而造成了色谱峰谱带的展宽，降低了柱效。而CEC是采用电场推动流动相。其线速度是与柱的直径和填微粒的大小无关的，因而在毛细管中几乎没有流速梯度。谱带展宽效应相应的就十分小。这点是CEC与 HPLC的本质差别，也是 CEC效率高于HPLC的根本六 毛
31、细管等速电泳（capillary isotachophoresis ，CITP ）1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管 )和尾随离子， 试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“ 2”
32、号中离子跑到“ 1”号区，离子被减速使之归队；4. 特点 ：界面明显，富集、浓缩作用；双向电泳第一向进行 等电聚焦 ，蛋白质沿pH 梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离(SDS-PAGE ) 蛋白质组 (Proteome):由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质蛋白质组学 (Proteomics):集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制. 琼脂糖凝胶电泳印迹分析蛋白质的印迹蛋白质的印迹Western blotting SDS-PAGE 电转移NC纸PVDF 尼龙膜
33、斑点杂交 (dot blotting) ，精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 14 页读书之法 ,在循序而渐进 ,熟读而精思常用的检测手段方法免疫方法（免疫印迹）核酸的印迹DNA Southern blotting RNA northern blotting 方法毛细管印迹（转移）电印迹（转移）检测手段各种标记探针的杂交免疫电泳 ：将电泳的分离方法与免疫学的检测方法结合的一种对蛋白质的检测方法分析抗体 -抗原的常见方法：免疫沉淀法、双扩散法、免疫电泳ELISA ： 酶联免疫测定：基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表
34、面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。应用亲和素和生物素的ELISA ：亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。生物素（ biotin ）又称维生素H，存在于蛋黄中。用化
35、学方法制成的衍生物，生物素羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide ，BNHS ）可与蛋白质、 糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。 由于 1 个亲和素分子有4 个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高 ELISA的敏感度。蛋白质序列测定肽序列分析的基本步骤：（1）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。（2）测定头尾氨基酸。（3）把肽链水解成片段，分别进行分析，得到肽图。（4）Edman降解精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 14 页