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1、University Code ： 10225 Register Code ： 09389 Dissertation for the Degree of Master Study on Tolerance to Heavy Metal of Ferritin Gene Over-expression and Transformation of P.davidiana XRbolleana Candidate: Academic Advisor: Associate Advisor: Academic Degree Applied for: Specialty: Date of Oral Pre
2、sentation: University: Du Renjie As. Prof. Bao Yihong Prof. Jiang Tingbo Master Forest Plant of Resources April, 2009 Northeast Forestry University 摘要 将具有卡那霉素抗性的转烟草铁蛋白基因 (JWFeri) restrain the decompounding of chlorophyll; increase the activity of POD and SOD and boost the plant growth quantity at di
3、fferent levels. These results also show the NtFerl from tobacco possesses the ability of cleaning up reactive oxygen and the function of resisting several metal pollution more than those of non-transformant. Employing Agrobacteria-mediated leaf disc transformation method, the gene encoding tobacco f
4、erritin (NtFerl) was introduced into the genome of Populus, and the Kanamycin tolerance, PCR-southem and Northern hybridization analysis indicated that exogenous gene ferritin gene correctly over-expressed. The heavy metal uptake in plant is a hot topic in the research field of environmental polluti
5、on, phytoremediation is a treatment technique by using plants to clean up heavy metal in soil. In the industry manufacture, the materials always are some different heavy metals, that results the pollution of soil and water in one region rarely worked by single metal. In this view, using genetic engi
6、neer to improve plant physiological performance to different heavy metal pollutants, developing transformants that can resist or enrich several different heavy metal pollutants at the same time holds a more significant sense and a more hopeful prospect in phytoremediation. Keywords: Tobacco; Ferriti
7、n; heavy metal stress; Physiologic characters; Genetic transformation mm . i Abstract . II 1 .l 1- 1重金属污染概述 . 1 1.1.1重金属污染对植物生长发育的影响 . 2 1.1.2重金属胁迫对植物生理生化过程的影响 . 3 1.1.3对植物体内水分的影响 . 4 1.1.4对植物体内矿物质的影响 . 4 1.2植物对重金属的保护防御机制 . 4 1.2.1保护性酶系统的活性提高 . 4 1.2.2体内可溶性蛋白、脯氨酸含量提高 . 5 1.2.3细胞中 的区室化 . 5 1.2.4蛋白类保护
8、剂 . 5 1.3植物金属铁蛋白的研究进展 . 6 1.3.1铁在生物体内的主要生理作用 . 6 1.3.2植物金属铁蛋白的主要作用 . 7 1.3.3转植物铁蛋白基因研究进展 . 8 1.3.4国内外研究现状 . 8 1.4植物转基因的研究进展 . 9 1_4.1植物转基因的发展 . 9 1.4.2转基因技术在林业生产中的应用 . 1 1.4.3林木转基因方法 . 1 1A4转基因杨树的研究价值 . 1 1.5研究展望 . 11 2 A/fFerf基因对重金属抗性的功能验证 . 12 2.1试验材料 . 12 2.1.1植物材料 . 12 2- 1.2培养基 . 12 2.1.3主要试剂及仪
9、器 . 12 2.2试验方法 . 12 2.2.1子二代 (T2)转基因烟草组培苗的六种重金属离子胁迫处理 . 12 2.2.2超氧化物歧化酶 (SOD)活性测定 . 13 2.2_3过氧化物酶 (POD)活性测定 . 13 2.2.4丙二醛 (MDA)含量测定 . 14 2.2.5 株高 . 15 2.2.6 鲜重 . 15 2.2.7叶绿素含量 . 15 2.3结果分析 . 15 2.3.1转 A/fFer7基因烟草丁 2代抗重金属 Pb2+分析 . 15 2.3.2转 /VfFer7基因烟草 T2代抗重金属 Cd2+分析 . 19 2.3.3转 基 因 烟 草 T2代抗重金属 Zn2+分
10、析 . 23 2.3.4转 A/fFer7基因烟草 T2代抗重金属 Co2+分析 . 26 2.3.5转 A/fFer7基因烟草 T2代抗重金属 Ni2+分析 . 30 2.3.6转 A/fferf基因烟草 T2代抗重金属 Mn2+分析 . 34 2.4 i寸 i仑 . 38 2.4.1长势差异 . 38 2.4.2转基因烟草在重金属胁迫下的生理生化反应 . 39 2.5本章小结 . 40 3 AftFery基因对山新杨的遗传转化和检测 . 41 3_1试验材料 . 41 3.1 _1植物材料 . 41 3.1.2转基因山新杨遗传转化培养基 . 41 3_1_3 试剂 . 41 3.1.4分子
11、检测用到的所有引物 . 42 3.2试验方法 . 42 3.2.1外植体的接种 . 42 3.2.2诱导及生根培养基和培养方法 . 42 3.2.3根瘤农杆菌介导的山新杨的遗传转化 . 43 3.2.4转基因山新杨检测 . 43 3.3结果与分析 . 47 3.3.1转基因山新杨的 PCR检测 . 47 3.3.2探针制备的电泳图 . 47 3.3.3转基因杨树的 Southern检测 . 47 3.3.4转基因山新杨的 Northern检测 . 48 3.4 48 3.4.1延迟梯度选择培养对山新杨转化的影响 . 48 3.4.2不同抗生素对农杆菌的抑制效果 . 49 3.5本章小结 . 4
12、9 . 50 . 51 附录 . 58 攻读学位期间发表的学术论文 . 60 SOM . 61 1绪论 1.1重金属污染概述 重金属污染是当今土壤污染中，污染面积最广、危害最大的环境问题之一 W。 随着 土壤重金属污染问题越来越突出，重金属在土壤一植物系统中的迁移转化也日益引起了 国内外土壤学、植物病理学家、植物生理学家以及环境学家的关注 【 2,3,4】 。众所周知，根 际环境是在植物根系的吸收和分泌两个动态过程作用下形成的在物理、化学和生物学性 质方面不同于原土体的、复杂的、动态的微型生态系统根际环境不仅是物质和能量 交换的场所，同时也是养分、水分、有益或有害微生物，有机和无机污染物进入植
13、物体 的门户，是一个重要的环境界面，是土壤圈物质循环的重要环节 61。由于全球工业化的 影响，重金属废弃物或残渣的不当处理经常对周围土壤和水体造成严重的污染，使土壤 和水体中某些金属元素严重超标，进而对植物代谢和生长发育产生毒害作用，甚至造成 植物体死亡，是对生态环境造成危害极大的一类污 染物【 7,8,9】 。 造成根际环境污染的重金属主要包括镉 (Cd)、 铅 (Pb)、 锌 (Zn)、 镍 (Ni)、 锰 (Mi、 钴 (Co)、 铬 (Cr)、 铜 (Cu)、 汞 (Hg)、 砷 8)等 【 1()1。目前我国受 Pb、 Cd、 As、 Cr等重金属污 染的耕地面积近 2000万公顷，
14、约占总耕地面积的 1/5。农田土壤重金属污染主要源于肥 料中的杂质、污水灌溉和各种废弃物 11，对于农作物的产量和品质都具有严重影响。植 物吸收土壤中过量的重金属，不仅会严重影响自身的生长发育，还会通过食物链危害到 人类的健康和生命 12,13。重金属造成的污染具有隐蔽性、不可逆性和长期性等特点，它 们一旦进入土壤、水体等生活环境中，采用物理的、工程的和化学的方法很难消除。大 多数重金属以液态、离子态、有机态和颗粒态等多种形态存在，有些甚至还能以蒸汽的 形式存在，危害人类生活及身体健康。 Cd是一种分布较广的重金属，在有色金属开采、冶炼、电镀等生产和加工过程 中，都会不同程度地排放到大气中，并
15、以干湿沉降的方式进入土壤。水体中的 Cd最终 大部分也进入了农业生态系统，使土壤的 Cd污染日趋严重，造成农产品品质下降。农 药、化肥、和地膜是重要的农用物资， 对农业生产的发展起着重大的推动作用，但长期 不合理施用，也可以导致土壤重金属污染。磷肥中含有较多的有害金属，研究发现施肥 后 Cd的含量从 0.13mg/kg上升到 0.32mg/kg1又对长期定位肥料试验土壤中重金属的含 量变化测定，结果表明，随耕作年限的增长，实验区土壤中的 Cd、Pb含量总体呈上僧 趋势，施肥 (磷肥 )是重金属含量增加的主要原因 151。近年来，地膜大面积的推广使用， 造成了土壤的白色污染。由于地膜声场过程中加
16、入了含有 Cd、 Pb的热稳定剂，同时也 增加了土壤重金属污染。引用污水灌溉是重金属在耕 层含量增高的主要原因，如钢铁 厂、化工厂、印染厂、村办电镀厂以及煤矿、铅锌矿等排出的废水中含有较多的 Zn、 Cd、 Pb等重金属，它们随着污水引溉被大量带进土壤。城市郊区的菜地和果园长期以 来多有施用垃圾肥的习惯，使重金属随垃圾肥进入土壤。 Cd、 Zn、 Pb对植物的伤害是 复杂的、多方面的，涉及生理代谢反应、形态反应等。 随着我国经济发展和科技进步，各类高科技电子产品在给人们带来便捷和快乐的同 时，也产生了电子废物，其中废弃锂电子电池污染最为普遍广泛，其正极材料为 LiMP04(M=Fe、 Mn、
17、Co、 Ni)， 导致 Mn、 Co、 Ni成为常见的土壤重金属污染物 16， 17。 此外， Mn、Co、 Ni普遍存在于矿区污染，金属矿山中的尾矿库是环境体系中重金属污 染的重要来源，尾矿是矿山开采过程中产生的一种固体废弃物，这些废弃物中含有浓度 较高的有毒重金属，当把它们从地下搬运至地表后，由于物理、化学条件的改变，尾矿 中重金属元素的释放、迁移会对附近土壤等地表生态环境产生严重的重金属污染，并通 过接触、食物链等途径直接或间接地危害人类 18。 Mn、 Co、 Ni通过损伤植物线粒体影 响呼吸作用，抑制叶绿体内化合物合成，抑制氧化磷酸化，影响质膜 ATP酶的活力， 影响光合作用，抑制细
18、胞有丝分裂，来抑制植物生长、发育甚至死亡，具有很强的毒 性。锂电子电池废物给环境带来了巨大压力，目前对其尚缺乏一套科学合理的回收处理 体系，而民间的分散回收和焚烧、酸洗等原始手段处理电子废物的方式，又在很大程度 上加剧了对环境的污染。锂电子电池废物被填埋或者焚烧时，其中的 Mn、 Co、 Ni渗入 土壤，进入河流和地下水，将会造成土壤和地下水的污染，直接或间接对植物和人类造 成伤害。选择耐重金属植物对于生产绿色食品、治理环境污染和保护生态环境有重要意 义。 鉴于重金属污染在全球生态系统中的重要影响，二十世纪以来，国内外许多科学家 都为治理环境污染出谋划策 19。一些学者进行了单一重金属在土壤
19、_植物系统中迁移与 转化的研究 2()。目前人们研究比较多的是植物对土壤中重金属的吸收特性和吸收机理以 及对其如何进行污染防治 21。用植物修复受污染土壤系统是一项新兴的高效、低成本的 绿色植物原位环境治理技术 22, 231，用来修复污染土壤系统的植物应具有高的生物量且能 忍耐和积累 污染物，被称为超富集植物。在植物修复策略中，理想的植物应具备高生物 量、高积累量、生长快速、具有发达根系等特点，但同时具有这些性状的植物在自然界 中很难找到，利用基因工程技术把关键基因导入速生植物，培育基因工程植物新品种代 表了植物修复发展的方向。多数研究着眼在同一种植物对不同重金属如 Cu、 Cr、 Zn、
20、Pb等的吸收特性，也就是研究重金属复合污染情况，如魏树和等研究农田杂草重金属 积累特征，来筛选重金属超富集植物 24。因此，研究植物抗逆分子机制，获得其抗重金 属基因，利用基因工程技术，培育抗重金属污染的 植物新品种，提高植物对重金属的抗 性及富集能力对于治理环境污染有重要意义。 1.1.1重金属污染对植物生长发育的影响 当外界重金属浓度超过一定限度时，植物质膜透性、各种生理生化过程、生长环境 和营养状况受到不同程度的伤害，最后使植物的生长发育受到不同程度的抑制。一般情 况下，重金属对种子的毒害较轻。组织化学实验表明，种皮对重金属的渗透具有防御功 能 25,26,27。国内外许多学者对重金属影
21、响种子萌发、生长等方面做了大量的实验，研究 发现：部分重金属离子能够降低种子细胞膜透性，减少细胞内营养物质的外渗，对某些 种子的萌发有促进作用 28,29,3 。但当重金属超过一定浓度范围后就会抑制种子萌发 1。 植物地下部分和地上部分受重金属影响不同。重金属主要以非复合的自由离子形态通过 主动或被动吸收方式进入植物体内，由于被吸收的重金属离子大部分富集在根部，使植 物地下部分受到的影响更为显著，表现为：根系发育严重抑制，活力降低等 31， 32, 331地 上部分受重金属影响通常表现为生长迟缓、株体矮小、退绿、产量下降等症状 32,34,35,36, 371。这主要是由于重金属离子可与植物细
22、胞壁中的多糖反应，降低细胞壁中果胶质的粘 稠度，以及金属离子进入植物体内导致植物细胞及超微结构受损，引起植物新陈代谢紊 乱所致 38。 1.1.2重金属胁迫对植物生理生化过程的影响 细胞膜作为植物调节和控制细胞内外物质运输和交换的重要结构，其透性是评价植 物对污染物反应的常用指标之一，脂膜稳定性是细胞进行正常生理功能的基础 39。植物 受重金属胁迫后，植物细胞膜结构损伤，完整性被破坏，细胞膜透性增加，胞内物质外 流，细胞内酶及其代谢作用区域受破坏，细胞外渗液电 导度与污染物浓度成正相关 40。 重金属会影响捕光色素，使叶绿素含量下降，影响光合功能 41， 42。不同重金属离子对植 物叶绿素含量
23、的影响存在明显差异。重金属对杂交稻协优 818叶绿素含量的相关研究表 明：低浓度时， Cu2+离子会引起叶绿素含量降低， Hg2+、Cd2+离子则导致叶绿素含量增 加，且 3种重金属离子会导致叶绿素 a/b值升高；髙浓度时， 3种重金属均引起叶绿素 含量降低，叶绿素 a/b值下降，对叶绿素含量的影响为 ： Cu2+Hg2+Cd2+431。 重金属 会引起类囊体膨胀 【 43， H 45】，内囊体的膜结构及功能发生改变，进而限制 PSII相对电子 传递。如：过量的 Ci2+离子能够降低植物叶片中叶绿素的含量，破坏内囊体上的色素蛋 白复合体结构，影响植物的原初光化学反应和 PSII相对电子传递的传
24、输 46, 471。重金属 离子还可起到阻碍质体醌、类胡萝卜素的合成，抑制 Calvin循环中的酶活性等作用 48, 49 在细胞悬浮液中加入 lmmol/L Cd2+离子就会减少西红柿根部氧的消耗。通常认为 Cd2+离子会抑制电子和质子在线粒体中的传导，破坏电子传递链的反应过程 5。引起植物呼吸作用和氧化磷酸化的紊乱。植物 体内组氨酸含量增加 68，抗氧化物质、渗透调节物质、保护蛋白的增加 69等都会引起体 内水分含量变化。 1.1.4对植物体内矿物质的影响 由于金属离子结构的相似性，使得植物受金属离子毒害后，对阳离子 (K+、 Ca2+、 Mg2+、 Zn2+、Cu2+、 Fe3+)、 阴
25、离子 (NO3)等矿物质营养的吸收发生改变 61。受匸 (12+离子 胁迫后大白菜、红花草中 Cu2+离子含量减少 7水稻中 Cu2+离子含量会增加；而黄瓜和 南瓜中其含量变化不大 71，这说明不同金属离子在不同植物中的代谢途径是不同的。目 前主要有两种机制解释植物受金属胁迫后，对矿物质营养吸收能力降低的原因。一种机 制认为，生物体内的物理和化学机制取决于金属离子半径，即金属离子半径适度，植物 易 吸 收 该 金 属， 如： 植 物 对 Cd2+(1.03人 )的吸收能力要高于对 Zn2+(0.83A)TO 72和 32+丨 1.06 4的吸收 7()， 71。另一种机制认为，植物受到金属胁迫
26、后，改变细胞代谢途 径，导致细胞及细胞器上酶结构和膜结构发生 改变，质膜的组分中软脂酸含量增加，亚 油酸含量降低 61，进一步改变细胞膜透性，抑制细胞膜上酶活性，致使细胞质中离子平 衡被打乱。 1.2植物对重金属的保护防御机制 植物受到重金属胁迫后，植物自身会采取一系列机制抵抗重金属毒害 73。植物对重 金属的抗性分为：避性 (Avoidence)和耐性 (Tolerance)两种途径。一些植物通过某种外部 机制保护自身不吸收环境中高含量的重金属从而免收毒害，称之为避性。在该情况下植 物体内重金属的浓度不髙。耐性是指植物体内具有某些特定的生理机制，如：金属排斥 性 (Metal exclusion)、 金属富集 (Metal accumulation)等，在该情况下，即使植物体内具有 较高的金属浓度，也不会受害。不同植物因基因型不同其对重金属胁迫后的适应性有明 显差异。植物主要通过以下一些作用机理来应对重金属胁迫： 1.2.1保护性酶系统的活性提高 在正常情况下，植物细胞内活性氧 (reactive oxygen species， ROS)的产生和清除是平