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1、单克隆抗体制备技术 广州医学院检验系 徐霞基本概念n抗原决定镞（抗原表位）n细胞克隆n多克隆抗体n单克隆抗体Antigenic determinantn是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope).n细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团nPolyclonal antibody,PcAb：针对多种抗原决定簇的混合抗体nMonoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体杂交瘤技术的理论基础n淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体n细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性n利用代谢缺陷补救机
2、理筛选杂交瘤细胞，并克隆化，制备McAbn当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融合在一起。融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。细胞DNA合成途经1.替代途径：次黄嘌呤（H） HGPRT2.主要途径：氨 基 酸 鸟嘌呤核苷酸谷 氨 酰 胺 （A-）尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸 TK3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）HAT选择培养基的原理nHAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)抗原免疫的脾细胞 小鼠骨髓
3、瘤细胞 （B细胞） （B细胞恶性肿瘤） 1. 抗体分泌（Ig+) 1.具永生性 2.HGPRT+在HAT生长 2.8-AG筛选出 HGPRT-株 PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+） 融合的结果及命运杂交瘤细胞未融合的脾细胞未融合的骨髓瘤细胞脾-脾杂交细胞骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞 免疫动物 培养骨髓瘤细胞 收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞 检测筛选阳性细胞 克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水） McAb 纯化及鉴定 制备单克隆抗体的基本技
4、术1 抗原提纯与动物免疫2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合4 抗体检测5 杂交瘤的克隆化和冻存6 McAB的制备7 单克隆抗体的纯化n免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血清中抗体效价不一定最高。n可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复多次） 冲击免疫（融合前3天进行）n选用6-12周龄Balb/c小鼠n颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果 n可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 n目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如将可溶性抗
5、原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。nn骨髓瘤细胞系选择要点：n稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT缺陷株n常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 等。n保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清）n融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95 n融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中 n常用的饲养细胞有：小鼠
6、腹腔巨噬细胞 n饲养细胞一般在融合前一天制备n免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天后的脾脏。n融合比例：n骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10n融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）n融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液 2周后 改用一般培养液n一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤细胞系。n可靠的筛选方法须在融合前建立，避免由于方法不当贻误筛选时机。n克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。n克隆化的原则：尽早进行，
7、反复4-5次n克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆法n阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及污染n单抗生产的方法：n动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后出现腹水，无菌采集。单抗纯化方法：n盐析n凝胶过滤n离子交换层析n亲和层析法n辛酸沉淀法n用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出。 血清 50%饱和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白凝胶过滤法n干燥的凝胶颗粒吸
8、水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。n交联葡聚糖凝胶(Sephadex)n琼脂糖凝胶(Sepharose)离子交换层析法nDEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂nCM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂亲和层析法n将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（
9、或抗原）。nA蛋白-Sepharose CL 4Bn单克隆抗体特性n理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备单克隆抗体在医学中的应用n检验医学诊断试剂n（1）病原微生物抗原抗体的检测n（2）肿瘤抗原的检测n（3）免疫细胞及其亚群的检测n（4）激素测定n（5）细胞因子的测定n蛋白质的提纯n肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术基因工程抗体与抗体库技术n单抗体内应用和疗效受限原因：n1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性n2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少n3.生产成本高,难于普及应用n人杂交瘤技术未获真正突破原因:n融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫n基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。n抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针对任何抗原的单克隆抗体。n临床上欲开展急性心肌损伤特异性标志物人心肌肌钙蛋白I（cTnI）的检测项目，现提供给你重组cTnI抗原，请你设计可行性实验方案。