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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流南农细胞生物学6.精品文档.第八章 细胞核与染色体 细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传与代谢的调控中心。自1831年RBrown首次命名细胞核(nucleus)以来，对于细胞核的研究始终倍受重视。 所有真核细胞，除高等植物韧皮部成熟的筛管和哺乳动物成熟的红细胞等极少数例外，都含有细胞核。一般说来，真核细胞失去细胞核后不久即导致细胞的死亡。细胞核大多呈球形或卵圆形，但也随物种和细胞类型不同而有很大变化。细胞核与细胞质在体积之间通常存在一个大致的比例，即细胞核的体积约占细胞总体积的10左右，这被认为是制约细胞最大体积的主要因素之十
2、。核的大小依物种不同而变化，高等动物细胞核直径一般为510 mm，高等植物细胞核直径一般为520 mm，低等植物细胞核直径约14mm。 细胞核主要由核被膜、染色质、核仁及核骨架组成(图81)。细胞核是遗传信息的贮存场所，在这里进行基因复制、转录和转录初产物的加工过程，从而控制细胞的遗传与代谢活动。 第一节 核被膜与核孔复合体 核被膜(nuclear envelope)位于间期细胞核的最外层，是细胞核与细胞质之间的界膜。由于它的特殊位置决定了它有两方面的功能，一方面核被膜构成了核、质之间的天然选择性屏障，它将细胞分成核与质两大结构与功能区域：DNA复制、RNA转录与加工在核内进行，蛋白质翻译则局
3、限在细胞质中。这样就避免了彼此相互干扰，使细胞的生命活动更加秩序井然；同时核被膜还能保护核内的DNA分子免受由于细胞骨架运动所产生的机械力的损伤。另一方面，核被膜并不是完全封闭的，核质之间有频繁的物质交换与信息交流，这主要是通过核被膜上的核孔复合体进行的。核被膜在普通光学显微镜下难以分辨，在相差显微镜下，由于细胞核与细胞质的折光率不同，可以看出核被膜的界限，只有在电子显微镜下才能看清核被膜的细微结构。关于核被膜的结构组成，目前有两种看法，一种意见认为核被膜有三种结构组分，即双层核膜、核孔复合体与核纤层(图81)。核纤层(nuclear lamina)紧贴内层核膜下，是一层由纤维蛋白构成的网络结
4、构，它与胞质中间纤维、核内骨架有密切联系。当真核细胞用非离子去垢剂、核酸酶及高盐溶液等分级抽提后，核纤层往往与核孔复合体、胞质中间纤维、核内骨架一起被保存下来，成为贯穿于细胞核与细胞质的骨架结构体系；由此又有人认为核纤层不应该属于核被膜的一种结构组分。在这里我们把核纤层放在细胞骨架结构系统中介绍，本节着重介绍核被膜与核孔复合体。一、核被膜 (一)结构组成 核被膜由内外两层平行但不连续的单位膜构成。面向核质的一层膜被称作内(层)核膜(inner nuclear membrane)，而面向胞质的另一层膜称为外(层)核膜 (outer nuclear membrane)。两层膜厚度相同，均为75 n
5、m。两层膜之间有20 40nm的透明空隙，称为核周间隙(perinuclear space)或核周池(perinuclear cisternae)，其宽度随细胞种类不同而异，并随细胞的功能状态而改变。内、外核膜各有特点：外核膜表面常附有核糖体颗粒，且常常与糙面内质网相通连，使核周间隙与内质网腔彼此相通。从这种结构上的联系出发，外核膜可以看作是糙面内质网的一个特化区域。内核膜表面光滑，无核糖体颗粒附着，但紧贴其内表面有一层致密的纤维网络结构，即核纤层。内核膜上有一些特有的蛋白成分，如核纤层蛋白B受体(1amin B receptor，LBR)。 双层核膜互相平行但并不连续，内、外核膜常常在某些部
6、位相互融合形成环状开口，称为核孔(nuclear pore)。在核孔上镶嵌着一种复杂的结构，叫做核孔复合体。核孔周围的核膜特称为孔膜区(pore membrane domain)，它也有一些特有的蛋白成分，如核孔复合体特有的跨膜糖蛋白gp210、Poml21等。 (二)核被膜在细胞周期中的崩解与装配 在真核细胞的细胞周期中，核被膜有规律地解体与重建。在分裂期，双层核膜崩解成单层膜泡，核孔复合体解体，核纤层去装配；到分裂末期，核被膜开始围绕染色体重新形成。那么，子细胞的核被膜是来源于旧核被膜碎片?还是来自其他膜结构?对此一直有两种意见。通过对变形虫的研究，很多人支持第一种说法，即新核膜来自旧核膜
7、。将变形虫培养在含有3H胆碱的培养基中，3H胆碱掺人到膜脂的磷脂酰胆碱中，这样核膜便被3H标记。将带有放射性标记的核取出，移植到正常的去核变形虫中，追踪观察一个细胞周期，结果发现子代细胞形成后，原有的放射性标记全部平均分配到子细胞的核被膜中，说明旧核膜参与了新核膜的构建。对于核膜装配的机制及其与核孔复合体、核纤层的关系，目前尚无定论。一种以非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵提取物为基础的非细胞核装配体系(cell-free nuclear assembly system)为研究该问题提供了很好的实验模型。非洲爪蟾的卵母细胞成熟后处于第二次减数分裂中期，此时的卵母细胞体积很大，直径可达
8、1mm，其中储存了大量的营养物质，为受精后快速卵裂做准备，一个成熟的卵母细胞所储备的原料可供形成103104个细胞核。现已设法将这种卵提取物在体外(in vitro)成功地模拟出细胞核的构建及解体过程。目前越来越多的证据表明，一种直径200 nm左右的单层小膜泡直接参与了核膜的形成。它们首先附着到染色质表面，在染色质表面排列并相互融合形成双层膜，同时在膜上的某些部位内、外膜相互融合并形成核孔复合体结构。对HeLa细胞的有丝分裂过程进行研究发现，核被膜在细胞周期中发生有序的去装配与重装配。从处于分裂期的HeLa细胞中可以分离出两种膜泡组分：一组富含LBR，另一组富含 gp210。这说明核被膜的去
9、装配不是随机的，而是具有区域特异性(domain- specific)。在有丝分裂后期核被膜重新装配时，富含LBR的膜泡首先与染色质结合，而富含gp210的膜泡与染色质结合较晚。此外，核被膜的去装配、重装配变化受细胞周期调控因子的调节，这种调节作用可能通过对核纤层蛋白、核孔复合体蛋白等进行磷酸化与去磷酸化修饰来实现。 二、核孔复合体 19491950年间，HGCallan与SGTomlin在用透射电子显微镜观察两栖类卵母细胞的核被膜时发现了核孔，随后人们逐渐认识到核孔并不是一个简单的孔洞，而是一个相对独立的复杂结构。1959年MLWatson将这种结构命名为核孔复合体(nuclear pore
10、 complex，NPC)。迄今已知所有的真核细胞，从酵 母到人，其间期细胞核普遍存在核孔复合体。核孔复合体在核被膜上的数量、分布密度与分布形式随细胞类型、细胞核的功能状态而有很大的差异。一般来说，转录功能活跃的细胞，其核孔复合体数量较多。一个典型的哺乳动物细胞核被膜上的核孔复合体总数约3 0004 000个，相当于1060个/mm2。 (一)结构模型 核孔复合体镶嵌在内外核膜融合形成的核孔上，核孔的直径约为80120 nm，而核孔复合体稍大一些，直径为120150 nm，因为它有一部分结构嵌入核被膜内。有关核孔复合体的结构一直是一个令人感兴趣的问题，自被发现以来，不断有新的结构模型提出，但至
11、今并不完善，仍有一些关键性的问题有待阐明。这主要是因为分离纯化核孔复合体的方法还不够完善，并且还受到电镜制样技术与观察方法的限制。研究核孔复合体形态结构的经典方法主要有三种：树脂包埋超薄切片技术、负染色技术与冷冻蚀刻技术(图82)。20世纪80年代以来，计算机图像处理技术应用于电镜的图像分析，高分辨率场发射扫描电镜技术 (HRFESEM)的发展，以及快速冷冻冷冻干燥制样技术的发展，使人们对核孔复合体的形态结构有了更深入的了解。综合已有的资料人们提出了一个最新的核孔复合体结构模型(图83)。细胞核用电镜超薄切片技术(A)和冷冻蚀刻技术 (B)显示的核孔复合体(NPC) 图83 核孔复合体结构模型
12、(引自BAlberts) 对于这个模型的结构组成目前有两种理解：从横向上看，核孔复合体由周边向核孔中心依次可分为环、辐、栓三种结构亚单位；从纵向上看，核孔复合体由核外(胞质面)向核内(核质面)依次可分为胞质环、辐(十栓)、核质环三种结构亚单位，形成“三明治”(sandwich)式的结构。综合起来，核孔复合体主要有以下4种结构组分：胞质环(cytoplasmic ring)：位于核孔边缘的胞质面一侧，又称外环，环上有8条短纤维对称分布伸向胞质；核质环(nuclear ring)：位于核孔边缘的核质面一侧，又称内环，内环比外环结构复杂，环上也对称地连有8条细长的纤维，向核内伸人5070 nm，在纤
13、维的末端形成一个直径为60 nm的小环，小环由8个颗粒构成。这样整个核质环就像一个“捕鱼笼”(fish-trap)样的结构，也有人称为核篮(nuclear basket)结构；辐(spoke)：由核孔边缘伸向中心，呈辐射状八重对称。它的结构也比较复杂，可进一步分为三个结构域：主要的区域位于核孔边缘，连接内、外环，起支撑作用，称作“柱状亚单位”(column subunit)。在这个结构域之外，接触核膜部分的区域称为“腔内亚单位”(1uminal subunit)，它穿过核膜伸人双层核膜的膜间腔。在“柱状亚单位”之内，靠近核孔 复合体中心的部分称作“环带亚单位”(annularsubunit)，
14、由8个颗粒状结构环绕形成核孔复合体核质交换的通道；栓：或称中央栓(centralplug)，位于核孑L的中心，呈颗粒状或棒状，所以又称为中央颗粒(centralgranule)；由于推测它在核质交换中起一定的作用，所以还把它叫做“transporter”。不过不是在所有的核孔复合体中都能观察到这种结构，因此有人认为它不是核孔复合体的结构组分，而只是正在通过核孔 复合体的被转运的物质。由上述结构模型可见，核孔复合体对于垂直于核膜通过核孔 中心的轴呈辐射状八重对称结构，而相对于平行于核膜的平面则是不对称的，即核孔复合体在核质面与胞质面两侧的结构明显不对称，这与其在功能上的不对称性是一致的。 最近，
15、对于fish-trap”结构又有新的发现。HRis与MMalecki运用高分辨率场发射扫描电镜(HRFESEM)观察非洲爪蟾卵母细胞核膜上的核孔复合体，发现fish-trap并非中断并游离在核质中，而是与一种称为“cable”的网络通道相连通。这种cable由与“fish-trap”类似的结构单位串联而成，看上去像是“fish-trap”上的纤维与小环在核质中的周期性重复与延续。从fish-trap”末端小环的8个颗粒上又发出8条细长的纤维，在纤维上周期性地间隔有8个颗粒构 成的环状结构。不同的“fishtrap发出的cable相互交叉，使cable成为一个遍布核质、相互贯通的复杂的网络。这种
16、与“fishtrap相连、相似的cable有何功能尚不清楚，推测它很可能与核孔复合体的核质转运功能有关。 (二)核孔复合体成分的研究 核孔复合体主要由蛋白质构成，其总相对分子质量约为125 000X103，推测可能含有100余种不同的多肽，共1 000多个蛋白质分子。最近两年，分离鉴定核孔复合体蛋白成分的工作进展很快，特别是生化与遗传学技术相结合，在酵母中已鉴定出30余种与核孔复合体相关的蛋白成分。迄今已鉴定的脊椎动物的核孔复合体蛋白成分也已达到十多种(表81)，其中gp210与p62是最具有代表性的两个成分，它们分别代表着核孔复合体蛋白的两种类型。实际上，这两类蛋白成分在从酵母到人的多种生物
17、中都已被发现证实，它们在不同的物种中有很强的同源性；核孔复合体的整个结构在进化上是高度保守的。目前人们倾向于把所有的核孔复合体蛋白统一命名为“核孔蛋白”(nucleoporin，Nup)。 表81 已知的脊椎动物核孔复合体的蛋白成分简表蛋白名称 gp210代表一类结构性跨膜蛋白，是第一个被鉴定出来的核孔复合体蛋白，相对分子质量为210X103，位于核膜的“孔膜区”，故认为它在锚定核孔复合体的结构上起重要作用。其糖基化修饰位点在天冬酰胺残基上，为N连接甘露糖残基寡糖链，因而与刀豆球蛋白A(ConA)有较强的结合作用。它在糙面内质网上新合成时，N端带有信号肽，但并不参与核孔复合体结构的形成。目前认
18、为 gp210主要有三方面的功能：介导核孔复合体与核被膜的连接，将核孔复合体锚定在“孔膜区”，从而为核孔复合体装配提供一个起始位点；在内、外核膜融合形成核孔中起重要作用。gp210氨基酸序列中有两段疏水区，其中靠近C端的疏水区位于孔膜区，是跨膜结构域，另一段疏水区则位于核周间隙内，推测当核孔复合体装配开始时，gp210位于核周间隙内的肽段构象发生变化，从而使其中的疏水区暴露，使之与核膜相互作用，通过这一方式诱导内外核膜融合；在核孔复合体的核质交换功能活动中起一定作用，如gp210核周间隙内肽段的抗体能够降低蛋白质人核转运的速度。后来又报道发现另外一种位于孔 膜区的蛋白成分，命名为Poml21。
19、 p62代表一类功能性的核孔复合体蛋白。它带有O连接N乙酰葡萄糖胺残基(O-linked GlcNac)寡糖修饰，因此与麦胚凝集素(WGA)有较强的亲和性。脊椎动物的p62分子主要分为两个结构域：疏水性N端区，具有XFXFX (F：苯丙氨酸；x：任意氨基酸)形式的重复序列，由其氨基酸序列推测适合形成b折叠结构；糖基化修饰发生在这个区域中接近C端区的肽段。这个区域可能在核孔复合体功能活动中直接参与核质交换。C端区，具有疏水性的七肽重复序列，类似一些纤维蛋白(如中间纤维蛋白、核纤层蛋白)的杆状区，适合形成a螺旋。推测这个区域可能通过卷曲螺旋与其他核孔复合体蛋白成分相互作用，从而将p62分子稳定到核
20、孔复合体上，为其N端进行核质交换活动提供支持。p62对核孔复合体行使正常的功能非常重要。目前，这一类核孔复合体蛋白成分已有很多被鉴定出来，其中有些像p62一样带有O连接GlcNac类型的糖基化修饰，并且含有一些重复序列，如Nupl53中的FXFG(F：苯丙氨酸，X：任意氨基酸，G：甘氨酸)，Nup98中的GLFG(L：亮氨酸)，也有些没有任何糖基化修饰或类似的重复序列。 (三)核孔复合体的功能：核质交换的双向选择性亲水通道 从功能上讲，核孔复合体可以看作是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，并且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道。双功能表现在它有两种运输方式：被动扩散与主动运输。双向性表现在既
21、介导蛋白质的人核转运，又介导 RNA、核糖核蛋白颗粒(RNP)的出核转运(图84)。 1通过核孔 复合体的被动扩散 核孔复合体作为被动扩散的亲水通道，其有效直径为910 nm，有的可达 125nm，即离子、小分子以及直径在10 nm以下的物质原则上可以自由通过。对静止期核孔的有效大小是通过将标记的非核组成成分注射到细胞质中，计算它们向核内扩散的速率来研究的。将聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone， PVP)包被的胶体金颗粒，通过显微注射引入变形虫细胞质内，然后在电镜下检查金颗粒的分布，结果发现它们是经过核孔复合体的中心进入细胞核的，估计中央通道的直径为125 nm。通过核孔
22、复合体的扩散速度与分子大小成反比，相对分子质量小于50X103的小分子可以自由扩散，17X103的蛋白质在2 min内可达到核质间平衡，44X103的蛋白质需30min达到平衡，而大于60X103的 球蛋白则几乎不能进入核内。根据这些定量分析资料推断，核孔复合体是一个圆形亲水通道，其功能直径为9 nm，长约15 nm的通道。这与电镜照片上可以看到的通道的大小是基本一致的。对于球形蛋白质，这种有效直径相当于允许相对分子质量在40X103一60X103以下的蛋白质分子自由穿过核孔。但实际上并不是所有符合这个条件的蛋白质都可以随意出入细胞核。有许多小分子的蛋白质，如组蛋白Hl，其相对分子质量虽只有2
23、1X103，但由于它本身带有具信号功能的氨基酸序列，所以是通过主动运输进入细胞核的；有的小分子蛋白质本 身虽然没有信号序列，但可以与其他有信号序列的成分结合，一起被主动运输到核内。因此，核孔复合体的这种被动扩散通道并不意味着所有10 nm以下的小分子在核被膜两侧就一定均匀分布。有些小分子蛋白质可能会因为与其他大分子相结合，或与一些不溶性结构成分(如中间纤维、核骨架等)结合而被限制在细胞质或细胞核内。 b 爪蟾卵母细胞核质蛋白注射实验(引自BAlberts) 2通过核孔 复合体的主动运输 生物大分子的核质分配如亲核蛋白的核输入，RNA分子及RNP颗粒的核输出，在细胞核功能活性的控制中起着非常重要
24、的作用。对于真核细胞来说，典型的哺乳类细胞的核被膜上有3 0004 000个核孔(约11个m2)，如果细胞正在合成DNA，为了确保染色质包装，则需要每3min从细胞质向核内输入106个组蛋白分子，这意味着每个核孔每分钟要运进100个组蛋白分子。如果细胞在迅速生长，则需要每个核孔每分钟从细胞核向细胞质输出三对核糖体大小亚基，以确保蛋白质合成的需要。现在已知，这种大分子的核质分配主要是通过核孔复合体的主动运输完成的，具有高度的选择性，并且是双向的。其主动运输的选择性表现在以下三个方面：对运输颗粒大小的限制。主动运输的功能直径比被动运输大，约1020 nm，甚至可达26 nm。像核糖体亚单位那样大的
25、RNP颗粒也可以通过核孑L复合体从核内运输到细胞质中，表明核孔复合体的有效直径的大小是可被调节的；通过核孑L复合体的主动运输是一个信号识别与载体介导的过程，需要消耗ATP能量，并表现出饱和动力学特征；通过核孔复合体的主动运输具有双向性，即核输入与核输出，它既能把复制、转录、染色体构建和核糖体亚单位装配等所需要的各种因子如DNA聚合酶、RNA聚合酶、组蛋白、核糖体蛋白等运输到核内；同时又能将翻译所需的RNA、装配好的核糖体亚 单位从核内运送到细胞质。有些蛋白质或RNA分子甚至两次或多次穿越核孔复合体，如核糖体蛋白、snRNA等。 近几年对于亲核蛋白的人核转运机制的研究进展较快。亲核蛋白 (kar
26、yophilic protein)是指在细胞质内合成后，需要或能够进入细胞核内发挥功能的一类蛋白质。大多数的亲核蛋白往往在一个细胞周期中一次性地被转运到核内，并一直停留在核内行使功能活动，典型的如组蛋白、核纤层蛋白等；但也有一些亲核蛋白需要穿梭于核质之间进行功能活动，如importins。通过研究核质蛋白(nucleoplasmin)的入核转运，人们逐步发现了指导亲核蛋白人核的信号。核质蛋白，相对分子质量165X103，是一个五聚体，在非洲爪蟾卵母细胞核中含量丰富。用蛋白水解酶进行有限的水解，可以分别得到头部片段(N端)与尾部片段(C端)。将带有放射性标记的完整核质蛋白或头、尾片段分别注射到爪
27、蟾卵母细胞的细胞质中，结果发现，完整的核质蛋白能够在细胞核内迅速地积累，同时发现尾部片段也能被高效地转运到核内，而头部片段却被拒之核外(图8 5)。显然有某种亲核的输入信号存在于尾部片段。如果把尾部片段包裹在直径 20 nm的胶体金颗粒上，然后注射到细胞质中，这种金颗粒也能在核内积累；换用完整的核质蛋白包裹胶体金颗粒可以得到同样的结果。现在已经证实，亲核蛋白一般都含有特殊的氨基酸序列，这些内含的特殊短肽保证了整个蛋白质能够通过核孔复合体被转运到细胞核内。这段具有“定向”、“定位”作用的序列被命名为核定位序列或核定位信号(nuclear localization sequence或nuclear
28、 localization signal，NLS)。第一个被确定序列的NLS来自猴肾病毒(SV40)的T抗原 (相对分子质量92X103)。这个NLS由7个氨基酸残基构成：ProLysLys LysArgLysVal。其中仅一个氨基酸残基突变就会导致该蛋白在胞质内不正常积累；如果将这段NLS序列连接到非亲核蛋白上，则非亲核蛋白就会被转运到核内。此后，又陆续鉴定出一些其他亲核蛋白的NLS。目前认为NLS是存在于亲核蛋白内的一些短的氨基酸序列片段，富含碱性氨基酸残基，如Lys、 Arg，此外还常常含有Pro。这些氨基酸残基片段可以是一段连续的序列，如上述SV40T抗原的NLS，也有分成两段存在于亲
29、核蛋白的氨基酸序列中，两段之间往往间隔约10个氨基酸残基，如核质蛋白的NLS。在不同的NLS之间尚未发现共有的特征序列。与指导蛋白质跨膜运输的信号肽不同，NLS序列可存在于亲核蛋白的不同部位，并且在指导亲核蛋白完成核输入后并不被切除。 亲核蛋白通过核孔复合体的转运是分步进行的，根据整个过程对能量的需求可粗略的分为两步：结合(binding)与转移(translocation)。亲核蛋白首先结合到核孔复合体的胞质面，这一步不需要能量，但依赖正常的NLS；随后的转移步骤则需要GTP水解供能。亲核蛋白除了本身具有NLS外，其人核转运还需要一些胞质蛋白因子的帮助。目前比较确定的因子有importina
30、、importin卢、Ran (一种GTP结合蛋白)和NTF2等。在它们的参与下，亲核蛋白的人核转运可分为如下几个步骤(图86)：亲核蛋白通过NLS识别importina，与可溶性 NLS受体importin。improtinb异二聚体结合，形成转运复合物；在importinb 的介导下，转运复合物与核孔复合体的胞质纤维结合；转运复合物通过改变构象的核孔复合体从胞质面被转移到核质面；转运复合物在核质面与Ran GTP结合，并导致复合物解离，亲核蛋白释放；受体的亚基与结合的Ran返回胞质，在胞质内RanGTP水解形成RanGDP并与importinb解离，Ran GDP返回核内再转换成RanGT
31、P状态， 亲核蛋白从细胞质向细胞核输入的过程示意图 应该指出，NLS只是亲核蛋白人核的一个必要条件，某种亲核蛋白是否被转运人核还受到其他因素的影响。已经发现有很多带有NLS的蛋白质由于种种原因滞留在胞质内。它们有的是因为其NLS的活性被封闭(masking)，如磷酸化修饰；有的是由于与“胞质滞留因子”(cytoplasmic retention factor)的结合，如与细胞骨架的结合导致亲核蛋白不能自由活动。总之，蛋白质人核转运作为一种重要的核质物质交换与信息交流活动，是受到多种因素综合调节的。 对于RNA及核糖体亚单位的出核转运机制了解得较少。真核细胞中RNA一般要经过转录后加工、修饰成为
32、成熟的RNA分子后才能被转运出核。由 RNA聚合酶I转录的rRNA分子，总是在核仁中与从胞质中转运进来的核糖体蛋白结合形成核糖体亚单位，以核糖核蛋白颗粒(RNP)的形式离开细胞核，转运过程需要能量；由RNA聚合酶转录的5S rRNA与tRNA的转运是一种由蛋白质介导的过程；由RNA聚合酶转录的核内不均一RNA(heterogeneous nuclearRNA，hnRNA)，首先需要在核内进行5，端加帽和3，端附加多聚A序列以及剪接等加工过程，然后形成成熟的mRNA出核。出核转运也是一个需要载体的主动运输过程。最近的研究表明，在细胞核中既有正调控信号保证mRNA的出核转运，也有负调控信号防止mR
33、NA的前体被错误地运输。由DNA转录出来的mRNA前体只有在核内经过转录后加工、修饰成为成熟的RNA分子后才能被转运出核。目前认为5端的m7GpppG帽子”结构对mRNA的出核转运 是必要的。防止mRNA的错误出核与剪接体(spliceosome)有关，实验证明在剪接体形成与mRNA出核转运之间存在竞争。mRNA的出核转运过程是有极性的，其5，端首先通过核孔复合体，3，端最后离开细胞核。此外，RNA分子的出核转运需要蛋白分子的帮助。真核细胞的snRNA、mRNA与tRNA，无论在细胞质还是在细胞核中，都是与相关的蛋白质结合在一起，即以各种RNP颗粒的形式存在的。所谓RNA的出核转运实际上是RN
34、A蛋白质复合体的转运，即 RNA的核输出离不开特殊的蛋白因子的参与，这些蛋白因子本身含有出核信号。目前人们正致力于寻找在RNA分子与核孔复合体之间起桥梁作用的信号与载体。已发现一些与RNA共同出核的蛋白因子，如HIV病毒的Rev蛋白，转录因子TFA，蛋白激酶A抑制因子PKI等，含有对它们的出核转运起决定作用的氨基酸序列，命名为核输出信号(nuclearexportsignal，NES)。此外，有迹象表明人核转运与出核转运之间有某种联系，如它们可能需要某些共同的因子。第二节 染色 质1879年，WFlemming提出了染色质(chromatin)这一术语，用以描述细胞核中能被碱性染料强烈着色的物
35、质。1888年，Waldeyer正式提出染色体的命名。经过一个多世纪的研究，人们对这种遗传物质的载体有了比较深入的认识。染色质和染色体是在细胞周期不同阶段可以互相转变的形态结构。下面将间期染色质和中期染色体分成两节叙述，完全是为了考虑章节内容的平衡及教学的方便。一、染色质的概念及化学组成 染色质是指间期细胞核内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质存在的形式。染色体是指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质聚缩而成的棒状结构。实际上，两者之间的区别主要并不在于化学组成上的差异，而在于包装程度不同，反映了它们处于细胞周期中不同的功能阶段。在真核细胞的细胞周
36、期中，大部分时间是以染色质的形态而存在的。 通过分离胸腺、肝或其他细胞的核，用去垢剂处理后再离心收集染色质进行生化分析，确定染色质的主要成分是DNA和组蛋白，还有非组蛋白及少量 RNA。大鼠肝细胞染色质常被当作染色质成分分析模型，其中组蛋白与DNA含量之比近于1：1，非组蛋白与DNA之比是06：1，RNADNA比率为01：1。 DNA与组蛋白是染色质的稳定成分，非组蛋白与RNA的含量则随细胞生理状态不同而变化。 (一)染色质DNA 凡是具有细胞形态的所有生物其遗传物质都是DNA。只有少数病毒遗传物质是RNA。在真核细胞中，每条未复制的染色体包装一条DNA分子。一个生物储存在单倍染色体组中的总遗
37、传信息，称为该生物的基因组(genome)。真核生物每个细胞中基因组DNA含量比原核生物高得多。大肠杆菌(Ecoli)的基因组含42X106bp，平均基因长12kb，基因数目约2 350；而真核生物酵母 (Scerevisiae)基因组34倍于大肠杆菌的DNA，为13X107bp，平均基因长 14kb，约有6 100个基因；果蝇(Dmelanogaster)高达40倍(14X108“bp)，平均基因长113kb，约有8 750个基因；人的单倍体基因组几乎高达800倍，为 3X109bp，平均基因长163kb，约有125 000个基因。然而，根据突变分析表明，并非所有基因都是必需基因(essen
38、tial gene)，酵母基因组有40的基因属于非必需基因(nonessential gene)，果蝇基因组只有5 000个必需基因。至于如此多的非必需基因如何保存下来尚不清楚，推测它们有可能在生物进化上提供某种选择优势。生物基因组中的遗传信息大体可分两类：一类是负责蛋白质氨基酸组成的信息，以三联体密码(triplet)方式进行编码，巧妙地解决了在有限的小空间储存大量遗传信息的矛盾。细胞中编码DNA序列在基因组中只占很小的比例，在高等哺乳类，这一比例大约只有5左右。这类编码序列主要是非重复的单一DNA序列，一般在基因组中只有一个或几个拷贝；另外一类是中度重复序列DNA，它们是关于基因选择性表达
39、的信息，这种选择性表现在：不同的物种、个体发育的不同阶段和不同的组织以及不同的细胞类型中，各种基因是关闭还是表达，表达的强度如何，都是各不相同的。这类起调控作用的DNA序列在整个基因组中占有很高的比例，并且能与调控蛋白相互作用而修饰自己的双螺旋空间结构，以便更好地为调控蛋白所识别。有些中度重复序列DNA具有编码功能，如编码rRNA和tRNA以及组蛋白的基因，但大部分中度重复序列不编码任何产物，这类重复序列又可分为两类：一类称短散在重复元件(short interspersedelements，SINEs)，典型SINEs其长度少于500 bp，如人和灵长类基因组中大量分散存在的Alu家族，人基
40、因组中约有50万到70万份Alu拷贝，相当平均每隔4kb就有一个Alu序列；另一类称长散在重复元件(long interspersed elements，LINEs)，典型LINEs其长度多于1 000 bp，如人基因组中L1家族，有 100 000个L1拷贝。这两类缺少编码功能的中度重复序列DNA是物种进化过程中在基因组中可移动的遗传元件，并且影响基因表达。此外，真核细胞基因组中，还含有高度重复DNA序列，每个基因组中至少含105拷贝，约占脊椎动物总 DNA的10。高度重复DNA序列由一些短的DNA序列呈串联重复排列，可进一步分为几种不同类型：卫星DNA(satelliteDNA)，重复单位
41、长5100 bp，不同物种重复单位碱基组成不同，一个物种也可能含有不同的卫星DNA序列。主要分布在染色体着丝粒部位，如人类染色体着丝粒区的a。卫星DNA家族，其功能不明。小卫星DNA(minisatelliteDNA)重复单位长12100 bp，重复3 000次之多，又称数量可变的串联重复序列，每个小卫星区重复序列的拷贝数是高度可变的，因此常用DNA指纹技术(DNA finger-printing)作个体鉴定；另外发现小卫星序列的改变可以影响邻近基因的表达，基因的异常表达又导致一系列不良 后效应。微卫星DNA(microsatelliteDNA)重复单位序列最短，只有15bp，串联成簇长度50
42、100bp的微卫星序列。人类基因组中至少有30 000个不同的微卫星位点，具高度微卫星多态性(microsatellite plymorphism)，不同个体间有明显差别，但在遗传上却是高度保守的，因此可作为重要的遗传标志，用于构建遗传图谱(genetic map)。 生物的遗传信息储存在DNA的核苷酸序列中，生物界物种的多样性也寓于DNA分子4种核苷酸千变万化的不同排列之中。DNA分子不仅一级结构具有多样性，而且二级结构也具有多形性(po1ymorphism)。所谓二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。DNA二级结构构型分三种： B型DNA(右手双螺旋DNA)是“经典”的
43、Watson-Crick结构，二级结构相对稳定，水溶液和细胞内天然DNA大多为B型DNA；A型DNA是一般B型DNA的重要变构形式，同样是右手双螺旋DNA，其分子形状与RNA的双链区和 DNARNA杂交分子很相近。第三种是Z型DNA，Z型DNA是左手螺旋，也是 B型DNA的变构形式。三种构型DNA的主要特征见表82。 三种构型DNA中，特别是大沟的特征在遗传信息表达过程中起关键作用。基因表达调控蛋白都是通过其分子上特定的氨基酸侧链与沟中碱基对两侧潜在的氢原子供体(=NH)或受体(O和N)形成氢键而识别DNA遗传信息的。由于大沟和小沟中这些氢原子供体和受体各异以及排列不同，所以大沟携带的信息要比
44、小沟多。此外，沟的宽窄及深浅也直接影响碱基对的暴露程度，从而影响调控蛋白对DNA信息的识别。B型DNA是活性最高的DNA构象；变构后的A型DNA仍有活性；变构后的Z型DNA活性明显降低。人们推测，在生理状态下，由于细胞内各种化学修饰的影响和结合蛋白的作用有可能使三种构型的 DNA处于一种动态转变之中。此外DNA双螺旋能进一步扭曲盘绕形成特定的高级结构，正、负超螺旋是DNA高级结构的主要形式。DNA二级结构的变化与高级结构的变化是相互关联的，这种变化在DNA复制与转录中具有重要的生物学意义。 (二)染色质蛋白 染色质DNA结合蛋白负责DNA分子遗传信息的组织、复制和阅读。这些 DNA结合蛋白包括
45、两类：一是组蛋白(histone)，与DNA非特异性结合；另一类是非组蛋白(nonhistone)，与DNA特异性相结合。 1组蛋白 组蛋白是构成真核生物染色体的基本结构蛋白，富含带正电荷的Arg和 Lys等碱性氨基酸，等电点一般在pHl00以上，属碱性蛋白质；可以和酸性的 DNA紧密结合，而且一般不要求特殊的核苷酸序列，用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将组蛋白区分为5种组分：H1、H2A、H2B、H3和H4。几乎所有真核细胞都含有这5种组蛋白，而且含量丰富，每个细胞每种类型的组蛋白约6“x107个分十。表83列举了5种组蛋白的一些特征。 5种组蛋白在功能上分为两组：核小体组蛋白(nucleosoma
46、l histone)，包括H2B、H2A、H3和H4，这4种组蛋白有相互作用形成聚合体的趋势，它们通过 C端的疏水氨基酸(如Val，11e)互相结合，而N端带正电荷的氨基酸(Arg、Lys)则向四面伸出以便与DNA分子结合，从而帮助DNA卷曲形成核小体的稳定结构。这4种组蛋白没有种属及组织特异性，在进化上十分保守，特别是H3和 H4是所有已知蛋白质中最为保守的。例如牛和豌豆的H4组蛋白的102个氨基酸残基中仅有2个不同，而它们的分歧时间已有3亿年的历史。这种保守性表明，H3和H4的功能几乎涉及它们所有的氨基酸，以致任何位置上氨基酸残基的突变对细胞都将是有害的。H1组蛋白，其分子较大(215个氨
47、基酸)，球形中心在进化上保守，而N端和C端两个“臂”的氨基酸变异较大，所以HI在进化上不如核小体组蛋白那么保守。在构成核小体时H1起连接作用，它赋予染色质以极性。H1有一定的种属和组织特异性，在哺乳类细胞中，组蛋白HI约有6种密切相关的亚型，氨基酸顺序稍有不同。在成熟的鱼类和鸟类红细胞中， H1为H5取代，有的生物如酵母(Saccharomycescerevzsae)缺少H1，结果酵母细胞差不多所有染色质都表现为活化状态* 2非组蛋白 与染色体组蛋白不同，非组蛋白(nonhistone)主要是指染色体上与特异 DNA序列相结合的蛋白质，所以又称序列特异性DNA结合蛋白(sequence spe
48、 cific DNA binding proteins)。利用非组蛋白与特异序列DNA亲合的特点，通过凝胶延滞实验(gel retardation assay)，可以在细胞抽提物中进行检测。首先制备一段带有放射性标记的已知特异序列的DNA。将要检测的细胞抽提物与标记 DNA混合，进行凝胶电泳。未结合蛋白的自由DNA在凝胶上迁移最快，而与蛋白质结合的DNA迁移慢，一般结合的蛋白质分子越大，DNA分子的延滞现象越明显，然后通过放射性自显影分析，即可发现一系列DNA带谱，每条带分别代表不同的DNA蛋白质复合物。每条带相对应的结合蛋白随后再通过细胞抽提物组分分离方法被进一步分开。 (1)非组蛋白的特性 非组蛋白具多样性和异质性 非组蛋白占染色体蛋白的6070，不同组织细胞中其种类和数量都不相同，代谢周转快。包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类如DNA和RNA聚合酶、HMG蛋白(high mobility group proteins，)、核质蛋白、染色体骨架蛋白、肌动蛋白和基因表达调控蛋白等。 对DNA具有识别特异性 能识别