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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。南农细胞生物学10-第十二章细胞分化与基因表达调控多细胞有机体是由各种不同类型的细胞组成的(表121)，而这些细胞又都是由一个受精卵细胞经增殖分裂和细胞分化衍生而来的后裔。在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程称为细胞分化(celldifferentiation)。细胞分化是多细胞有机体发育的基础与核心，细胞分化的关键在于特异性蛋白质的合成，而特异性蛋白质合成的实质在于基因选择性表达。正因为如此，本章的主题才定为细胞分化与基因表达调
2、表12几种生物的细胞数目与类型细胞类型在个体正常发育过程中，通过有控制的细胞分裂而增加细胞数目，通过有序的细胞分化而增加细胞类型，进而由不同类型的细胞构成生物体的组织与器官，执行不同的功能。显然，细胞分化为某种细胞类群通过相互协同作用完成各种复杂特殊的生物学功能，为生命向更高层次的发展与进化奠定了基础。尽管分化的细胞类型千差万别，但究其本质却是基因组保持相同而表达的基因有所不同，从而在形态结构、生理功能及生物学行为方面均有所不同。细胞分化过程常常伴随着细胞增殖与细胞凋亡，分化细胞的最终归宿往往是细胞的衰老和死亡。细胞癌变是细胞分化领域中的一个特殊问题，因为肿瘤细胞可以看做是正常细胞分化机制失控
3、的细胞，成为不衰老的永生细胞，丧失分化细胞的正常生理功能，形态上趋于一致，表现出某些未分化细胞的特征(有人称之为“去分化”)。然而肿瘤细胞的基因组却不同程度地发生了改变，其结果是正常机体的构建受到破坏，并丧失了相应的正常生物学功能。第一节 细胞分化一、 细胞分化的基本概念(一) 细胞分化是基因选择性表达的结果早期人们推测细胞分化是由于细胞在发育过程中遗传物质的选择性丢失所致。现代分子生物学的证据表明，细胞分化是由于基因选择性的表达各自特有的专一性蛋白质而导致细胞形态、结构与功能的差异。如鸡的输卵管细胞合成卵清蛋白，成红细胞合成b珠蛋白，胰岛细胞合成胰岛素，这些细胞都是在个体发育过程中逐渐产生的
4、。用编码上述三种蛋白的基因分别作探针，对三种细胞中提取的总DNA的限制性酶切片段进行Southern杂交实验。结果显示，上述三种细胞的基因组DNA中均存在卵清蛋白基因、 b珠蛋白基因和胰岛素基因(表122)；然而用同样的三种基因片段作探针，对上述三种细胞中提取的总RNA进行Northern杂交实验，结果表明，仅在输卵管细胞中表达卵清蛋白mRNA，而成红细胞中表达b珠蛋白mRNA，胰岛细胞中表达胰岛素mRNA(表表122)上述结果说明，不同类型的细胞在发育过程中表达一套特异的基因，其产物不仅决定细胞的形态结构，而且执行各自的生理功能。(二)组织特异性基因与管家基因细胞分化是通过严格而精密调控的基
5、因表达实现的。分化细胞基因组中所表达的基因大致可分为两种基本类型：一类是管家基因(house-keepinggenes)；另一类称为组织特异性基因(tissue-specificgenes)，或称奢侈基因(1uxurygenes)。管家基因是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。而组织特异性基因是指不同的细胞类型进行特异性表达的基因，其产物赋予各种类型细胞特异的形态结构特征与特异的生理功能。如卵清蛋白基因、上皮细胞的角质蛋白基因和胰岛素基因等。此外，有人还进一步分出一类调节基因(regulatorygene)，
6、其产物用于调节组织特异性基因的表达，或者起激活作用，或者起阻抑作用。因此，细胞分化的实质是组织特异性基因在时间与空间上的差异表达(differentialexpress)。这种差异表达不仅涉及到基因转录水平和转录后加工水平上的精确调控，而且还涉及染色体和DNA水平，翻译和翻译后加工与修饰水平上的复杂而严格的调控过程。应用mRNA差异显示法，DNA减法杂交和EST技术可在不同程度上分析分化细胞中的组织特异性基因。这方面也是后基因组学或功能基因组学研究的主要内容之一。(三)组合调控引发组织特异性基因的表达。人体至少有200多种(有的学者认为有500种以上)不同类型的细胞。如果每种类型的细胞分化都需
7、要一种基因表达调控蛋白的话，那么至少需要200种以上的调控蛋白，然而实际上是有限的少量调控蛋白启动为数众多的特异细胞类型的分化。其机制就是组合调控(combinationalcontr01)的方式，即每种类型的细胞分化是由多种调控蛋白共同调控完成的。这样，如果调控蛋白的数目是n”，则其调控的组合在理论上就可以启动分化的细胞类型为2n”(图121)。A、B、C为不同的调控蛋白当有三种调控蛋白存在时，则不同的组合就可能启动八种不同细胞类型的分化。然而在启动细胞分化的各类调控蛋白组合中，其中往往是只有一两种调控蛋白是起决定性的因子。这样，单一调控蛋白就有可能启动整个的细胞分化过程。最明显的例子是在成
8、肌细胞分化为骨骼肌细胞的过程中，一种关键性调控蛋白MyoD在体外培养的成纤维细胞中表达，结果使来自皮肤结缔组织的成纤维细胞表现出骨骼肌细胞的特征，如表达大量的肌动蛋白和肌球蛋白并构成收缩器，在质膜上产生对神经刺激敏感的受体蛋白和离子通道蛋白，并融合成肌细胞样的多核细胞等。显然在成纤维细胞中已经具备了肌细胞特异性基因表达所需要的其他必要调控蛋白，一旦加入MyoD后，即形成了启动肌细胞分化的特异的调控蛋白组合。借助于组合调控，一旦某种关键性基因调控蛋白与其他调控蛋白形成适当的调控蛋白组合，不仅可以将一种类型的细胞转化成另一种类型的细胞，而且遵循类似的机制，甚至可以诱发整个器官的形成。这一点已在研究
9、果蝇、小鼠和人眼发育中得到证实。在眼器官的发育中，有一种关键性调控蛋白称Ey(果蝇)或Pax(脊椎动物)。如将果蝇ey基因转入到早期发育中将发育成腿的细胞中表达，结果纠基因的异常表达最终诱导产生构成眼的不同类型细胞的有序三维组合，在腿的中部形成眼。显然Ey蛋白除了能启动细胞某些特异基因的表达，诱导某类细胞分化外，其启动的某些基因表达产物本身可能又是另一些基因的调控蛋白，它们进一步启动其他特异基因的表达，诱导分化更多的细胞类型，形成由多种不同类型细胞组成的有序三维细胞群体即导致器官形成。这种仅靠一种关键性调控蛋白通过对其他调控蛋白的级联启动，是一种令人惊奇的高效而经济的细胞分化启动机制。复杂的有
10、机体正是通过这一原则的重复运用逐渐完成形态建成的。(四)单细胞有机体的细胞分化细胞分化并非多细胞有机体独有的特征。单细胞生物甚至原核生物也存在细胞分化问题。如枯草杆菌芽孢的形成，啤酒酵母单倍体孢子的形成及萌发形成的a和a两种交配型。特别是粘菌(如盘形网柱粘菌Dictyosteliumdiscoideum)在孢子形成过程中，由单细胞变形体形成的蛞蝓形假原质团(pseudoplasmodium)，并进一步分化成为柄和孢子的过程，均涉及一系列特异基因的表达。这也是研究低等生物体细胞分化很好的材料。然而与多细胞有机体细胞分化的不同之处是：前者多为适应不同的生活环境，而后者则通过细胞分化构建执行不同功能
11、的组织与器官。因此，多细胞有机体在其分化程序与调节机制方面显得更为复杂。(五)转分化与再生一种类型的分化细胞转变成另一种类型的分化细胞的现象称转分化(transdifferentiation)，如水母横纹肌细胞经转分化可形成神经细胞、平滑肌细胞、上皮细胞，甚至可形成刺细胞。分化程度低的神经干细胞也可形成骨髓细胞和淋巴样细胞。转分化往往经历去分化(dedifferentiation)和再分化(redifferentiation)的过程。去分化又称脱分化，是指分化细胞失去其特有的结构与功能变成具有未分化细胞特征的过程。植物的体细胞在一定条件下形成未分化细胞群的细胞团愈伤组织，即为去分化现象。愈伤组
12、织可进一步诱导其再分化形成根和芽的顶端分生组织的细胞，并最终长成植株。生物界普遍存在再生现象(regeneration)，广义的再生可包括分子水平、细胞水平、组织与器官水平及整体水平的再生。但一般再生是指生物体缺失一部分后发生重建的过程，如幼体蟾蜍肢体切除后，伤口处部分细胞凋亡，多数细胞(包括皮肤、肌肉、软骨和其他结缔组织的细胞)经去分化形成间充质或纤维细胞样的细胞团再生芽基(regenerationblastema)，芽基细胞再分化形成以有序方式排列的从肱骨直至指骨的完整肢体，这一过程显然由同源异型基因的表达模式所调控。另一典型的例子是沃尔夫晶体的再生(Wolftianlensregener
13、ation)，若将发育中的蝾螈晶状体摘除，其背面的虹膜上含黑色素的平滑肌细胞就会去分化，失去黑色素和肌纤维，然后再分化或转分化成为产生晶状体蛋白的晶状体细胞。不同的多细胞有机体，其再生能力有明显的差异，一般来说，植物比动物再生能力强，低等动物比高等动物再生能力强。从水螅中部切下仅占体长5的部分，便可长成完整的水螅；而两栖类却只能再生形成断肢；人和其他高等动物只具有组织水平(除肝脏外)的再生能力。再生能力通常随个体年龄增大而下降。再生现象又从另一个侧面反映了细胞的全能性。在不同物种中，细胞分化状态的可塑性有很大不同。DNA的复制有利于重新编程和获得新的分化状态。当然，在再生过程中，有些细胞并不涉
14、及转分化，如肝细胞只是从Go期进入细胞周期。此外，再生过程也不能完全排除储备的多能干细胞的参与。二、影响细胞分化的因素通过组合调控的方式启动组织特异性基因的表达是细胞分化的基本机制。因此有必要从细胞的基因组人手来了解与分析影响细胞分化的因素。(一)细胞的全能性细胞全能性(totipotency)是指细胞经分裂和分化后仍具有产生完整有机体的潜能或特性，称为细胞的全能性。受精卵及早期的胚胎细胞都是具有全能性的细胞。植物的体细胞在适宜的条件下可培育成正常的植株，这不仅是细胞全能性的有力证据，而且也广泛地应用在植物基因工程的实践中。然而对动物细胞特别是高等动物细胞随着胚胎的发育，细胞逐渐丧失了发育成个
15、体的能力，仅具有分化成有限细胞类型及构建组织的潜能，这种潜能称为多潜能性(pluripotency)。具有多潜能性的细胞称为干细胞(stemcell)，如小鼠胚胎发育的囊胚期的原始内层细胞称为胚胎干细胞(embryostemcell)；成体中具有分化成多种血细胞能力的细胞称多能造血干细胞(图122)，它在造血器官骨髓中仅占细胞数的万分之一；仅具有分化形成某一种类型能力的细胞，称为单能干细胞(monopotentialcell)或称定向干细胞(directionalstemcell)。由定向干细胞最终形成特化细胞类型的过程称为终末分化(terminaldifferentiation)。一般情况下
16、，在整个发育过程中，细胞分化潜能逐渐受到限制而变窄，即由全能性细胞转化为多能和单能干细胞。但是对于细胞核而言，却始终保持其分化的全能性。早期利用两栖类动物进行核移植试验证明，将蛙的囊胚期细胞甚至蝌蚪的已经分化为肠上皮细胞的细胞核植入去核的卵子中，则可发育成蝌蚪甚至成蛙。随后，类似的实验在小鼠中也获得成功。这样用有限分化细胞的细胞核进行移植实验，证明了细胞核的全能性。显示出在分化过程中，绝大多数细胞均保持其完整的基因组或染色体组不变。1997年将羊的乳腺细胞的细胞核植入去核的羊卵子中，成功地克隆了多莉羊，进一步证明了即使是终末分化的细胞，其细胞核也具有全能性。然而与植物细胞不同，高等动物的体细胞
17、至今仍不能形成一个完整的个体，它不仅显示高等动物细胞分化的复杂性，而且也说明卵细胞的细胞质对细胞分化的重要作用。近年来，在体外由胚胎干细胞诱导分化成造血细胞、神经细胞、肌肉细胞以及神经干细胞可诱导分化成各种血细胞等一系列的研究结果，不仅加深了对细胞全能性和细胞分化机制的了解，而且在细胞治疗及用于组织与器官移植的组织工程(tisueenengineering)的研究与实践中都具有重要意义。(二)影响细胞分化的因素细胞中组织特异性基因的选择性表达主要是由调控蛋白所启动。调控蛋白的组合是影响细胞分化的主要的直接因素。一般来说，这种影响主要受胞外信号系统的调控，而胞外信号甚至细胞微环境的调控又是通过细
18、胞自身的因素如胞内因素、细胞位置等起作用的。在很多物种中影响细胞分化的胞内因素可以追溯到单细胞受精卵中细胞质的作用。此外，外部的环境对某些物种细胞分化乃至个体发育也会产生很大的影响。1胞外信号分子对细胞分化的影响在研究早期胚胎发育过程中发现，一部分细胞会影响周围细胞使其向一定方向分化，这种作用称近端组织的相互作用(promixatetissueinteraction)，也称为胚胎诱导。其中一个典型的例证就是在眼的发生中本身的逐级诱导过程。正常情况下，早期的视泡诱导与之接触的外胚层上皮细胞发育成晶状体，随后在视泡和晶状体的共同诱导下外面的表皮细胞形成角膜。如果把早期的视泡移植在头部的其他部位，同
19、样可诱导与之接触的外胚层发育成晶状体。近端组织的相互作用是通过细胞旁分泌产生的信号分子旁泌素(又称细胞生长分化因子)来实现的。已知它包括成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)、转化生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)以及hedgehog家族、Wnt家族和Juxtacrine等五大家族因子。与激素一样，它们都是影响细胞分化的重要的信号分子。另一种远距离细胞间相互作用对细胞分化的影响主要是通过激素来调节的。如无尾两栖类的蝌蚪变态过程中，尾部退化及前后肢形成等变化是由甲状腺分泌的甲状腺素和三碘甲状腺氨基酸的分泌增加所致。昆虫变态过程
20、主要是由20羟蜕皮素和保幼素共同调控的。人体血细胞定向分化也受到多种细胞因子的调控。2细胞记忆与决定信号分子的有效作用时间是短暂的，然而细胞可以将这种短暂的作用储存起来并形成长时间的记忆，逐渐向特定方向分化。果蝇的成虫盘(imaginaldisc)是一些初级分化的细胞群，而在幼虫变态过程中，不同的成虫盘发育为成虫不同的器官，如腿、翅和触角等。人们曾把果蝇的变态前幼虫的成虫盘细胞植入成虫体内，连续移植9年，细胞增殖多达1800代，然后将这种成虫盘细胞再移植回幼虫体内则依然没有失去记忆，照例发育成为相应的器官。早期的研究提出“决定早于分化”这一概念，所谓决定(determination)是指一个细
21、胞接受了某种指令，在发育中这一细胞及其子代细胞将区别于其他细胞而分化成某种特定的细胞类型，或者说在形态、结构与功能等分化特征尚未显现之前就已确定了细胞的分化命运。细胞的决定与细胞的记忆有关，而细胞记忆可能通过二种方式实现：一是正反馈途径(positivefeedbackloop)，即细胞接受信号刺激后，活化转录调节因子，该因子不仅诱导自身基因的表达，还诱导其他组织特异性基因的表达；二是染色体结构变化(DNA与蛋白相互作用)的信息传到子代细胞，如同两条X染色体中，其中一条始终保持凝集失活状态并可在细胞世代间稳定遗传一样。当然这些可能的记忆机制也可以用来解释某些能够继续增殖的终端分化细胞，如平滑肌
22、细胞和肝细胞分裂后只能产生与亲代相同的细胞类型。3受精卵细胞质的不均一性对细胞分化的影响由于细胞具有记忆能力，随着分化信息不断地积累使之成为“决定”了的细胞，这种与细胞分化相关的信息在很多动物中可以上溯至受精卵。在卵母细胞的细胞质中除了储存有营养物质和多种蛋白外，还含有多种mRNA，其中多数mRNA与蛋白质结合处于非活性状态，成为隐蔽mRNA，不能被核糖体识别。然而它们在卵细胞质中呈不均匀地分布，特别是某些动物如柄海鞘、两栖动物等，在受精后卵细胞质重新定位，少数母体mRNA被激活，合成早期胚胎发育所需要的蛋白质。随着受精卵早期细胞分裂，隐蔽mRNA不均一地分配到子细胞中。通过对角贝和海胆受精卵
23、发育的研究证明，在卵裂过程中不同的细胞质分配到不同的子细胞中，从而将决定未来细胞分化的命运，产生分化方向的差异。根据这一现象，人们提出了决定子(determinant)的概念，即指影响卵裂细胞向不同方向分化的细胞质成分。通过对果蝇生殖细胞和体细胞分化过程的比较研究，证明了果蝇卵细胞后端存在决定生殖细胞分化的细胞质成分即生殖质(germplasm)，它是种质细胞的决定子，这一现象普遍存在于动物界。显然决定细胞向某一方向分化的初始信息储存于卵细胞中，在很多物种中，卵裂后的细胞所携带的信息已开始有所不同，这种区别又通过信号分子影响其他细胞产生级联效应。这样最初储存的信息不断被修饰并逐渐形成更为精细更
24、为复杂的指令，最终产生分化各异的细胞类型。4细胞间的相互作用与位置效应在胚胎学研究中，人们已注意到细胞间的相互作用对细胞分化与器官构建的影响，并称这种作用为胚胎诱导(embryonicinduction)。胚胎诱导作用不断强化并可分成不同的层次，虽然人们对胚胎诱导作用的机制还不清楚，但包括旁泌素等信号分子的作用显然是其重要原因之一。细胞所处的位置不同对细胞分化的命运也有明显的影响。实验证明，改变细胞所处的位置可导致细胞分化方向的改变，这种现象称位置效应(positioneffect)。“位置信息”是产生效应的主要原因。如在鸡胚发育的原肠胚期，在由脊索细胞分泌的由Sonichedgehog的基因
25、编码的信号蛋白的作用下，靠近脊索的细胞分化形成底板(floorplate)，而远离脊索的细胞分化成运动神经元，如将另一个脊索植入鸡胚中线一侧，则会以同样方式诱导底板和运动神经元的发育。如果Sonichedgehog的基因发生突变，则会导致中枢神经系统发育异常，甚至可出现面部仅有一眼和一个鼻孔的畸胎。同样，Sonichedgehog蛋白也通过位置效应调节肢体的发育，趾的长度、形态和内部结构，均受控于细胞与这一蛋白信号分子源的距离，即取决于Sonichedgehog蛋白的浓度或某些由它调控的其他因子的浓度赋予肢芽分化的位置信息，最终发育形成由骨、软骨和皮肤等构成的不同的趾。5环境对性别决定的影响用
26、又称homeoticselectorgene，亦称Hox基因。这些基因都含有一段高度保守的由180bp组成的DNA序列，称同源框。同源框编码的60个氨基酸又称同源异型结构域，所形成的。螺旋转角。螺旋结构可与特异DNA片段中的大沟相互作用启动基因的表达。有趣的是同源异型基因在染色体上排列的次序不仅与这些基因在胚胎发育过程中活化的时间顺序是一致的，而且与它们沿躯体纵轴的空间表达时相也基本相符，如头区表达该基因簇的第一个基因，而躯体后部则表达基因簇最后一个基因。这种细胞分化调控的时间与空间上的程序浓缩在每一个细胞的染色体上。同源异型基因前后序列，是否仅仅是进化过程中的偶合，很值得探讨。更令人惊异的是
27、，Hox基因不仅存在于果蝇中，而且存在于多种无脊椎动物和高等的脊椎动物中。果蝇中有一套Hox基因，而脊椎动物中有4套Hox基因，它们都具有非常保守的同源框结构。不同动物中的同源异型结构域氨基酸序列的同源性一般为6080，在某些Hox基因中，如蛙XIHHox2基因与果蝇Antp基因的同源框所编码的60个氨基酸仅有一个不同。所有这些基因在细胞分化与发育中均具有类似的生物学功能。随着细胞分化与胚胎发育机制的深入了解，有关发育各阶段的分散的局部知识，正迅速汇集到一起，各种完全不同的生物实验模式逐渐显示出其内在的共性。正如拼板玩具一样迅速地向最终图谱迈进。长期令人困惑不解的细胞分化与发育过程的奥妙之处不
28、仅在于其过程与结果的复杂性，而且在于构建多种细胞组织及机体中难以置信的经济性。在生物长期演化过程中，很可能仅利用有限的较为简单的基因产物为工具，凭借重复而富有创造性的方式指导细胞的行为，分化并产生当今世界上多种生第二节癌细胞细胞分化的过程往往伴随细胞的分裂，即使DNA精确地复制与修复，其基因的碱基突变率也仅能达到106，从进化的角度看突变是选择的源泉，具有积极的意义。但如果在人的一生中，体细胞要分裂1016次，那么推断在基因组中每个基因都可能发生突变。基因突变的结果有可能招致某些分化细胞的生长与分裂失控，脱离了衰老和死亡的正常途径而成为癌细胞(cancercell)。细胞通过分裂与分化过程，形
29、成不同的细胞类型并由此构建有机体的组织和器官。而癌细胞的细胞类型趋于一致，破坏有机体的组织器官。癌细胞与正常分化细胞不同的一点是，不同类型的分化细胞都具有相同的基因组；而癌细胞的细胞类型与特征相近，但基因组却发生不同形式的突变。随着环境因素的影响，基因突变率提高，细胞癌变的几率也随之增加。因此，对癌细胞形成与特征的了解不仅有助于了解细胞增殖、分化与死亡的调节机制的细节，而且也为彻底治疗癌症这一维护人类健康所面临的十分严峻的问题提供线索和希望。一、癌细胞的基本特征动物体内细胞分裂调节失控而无限增殖的细胞称为肿瘤细胞(tumorcell)。具有转移能力的肿瘤称为恶性肿瘤(malignancy)，上
30、皮组织的恶性肿瘤称为癌。目前癌细胞已作为恶性肿瘤细胞的通用名称。其主要特征是：1细胞生长与分裂失去控制在正常机体中细胞或处于生长与分裂状态，或处于静止状态，执行其特定的生理功能(如肝细胞和神经细胞)。在成体的一些组织中，会有新生细胞的增殖，衰老细胞的死亡，在动态平衡中维持组织与器官的稳定，这是一种严格受控的过程。而癌细胞失去控制，成为“不死”的永生细胞，核质比例增大，分裂速度加快，结果破坏了正常组织的结构与功能。2具有侵润性和扩散性动物体内特别是衰老的动物体内常常出现肿瘤，这些肿瘤细胞仅位于某些组织特定部位，称之为良性肿瘤，如疣和息肉。如果肿瘤细胞具有浸润性和扩散性，则称之为恶性肿瘤，即癌症发
31、生。良性肿瘤与恶性肿瘤细胞的最主要区别是：恶性肿瘤细胞(癌细胞)的细胞间粘着性下降，具有浸润性和扩散性，易于浸润周围健康组织，或通过血液循环或通过淋巴途径转移并在其他部位粘着和增殖。经转移并在身体其他部位增殖产生的次级肿瘤称为转移灶(metastasis)。这是癌细胞的基本特征。此外，在分化程度上癌细胞低于良性肿瘤细胞，且失去了许多原组织细胞的结构和功能。3细胞间相互作用改变正常细胞之间的识别主要是通过细胞表面特异性蛋白的相互作用实现的，进而形成特定的组织与器官。癌细胞冲破了细胞识别作用的束缚，在转移过程中，除了要产生水解酶类(如用于水解基底膜成分的酶类)，而且要异常表达某些膜受体蛋白，以便与
32、别处细胞粘着并生长。同时借此逃避免疫监视作用，防止天然杀伤细胞等的识别和攻击。4蛋白表达谱系或蛋白活性改变癌细胞的蛋白表达谱系中，往往出现一些在胚胎细胞中所表达的蛋白，如在肝癌细胞中表达胚肝细胞中的多种蛋白。多数癌细胞中具有较高的端粒酶活性。此外癌细胞还异常表达与其恶性增殖、扩散等过程相关的蛋白成分，如纤连蛋白减少，某些癌蛋白过度表达。5mRNA转录谱系的改变癌细胞的种种生物学特征主要归结于其基因表达及调控方向的改变。人们曾用基因表达谱分析技术(serialanalysisOfgeneexpression，SAGE)对乳腺癌和直肠癌细胞与正常细胞中基因表达谱进行了比较。在检测的30万个转录片段
33、(transcripts)，至少相当于45万个所表达的基因中约有500个转录片段(相当于75个基因)有明显不同，仅占整个基因表达谱中的很少一部分。此外，由于癌细胞突变位点不同，同一种癌甚至同一癌灶中的不同癌细胞之间也可能具有不同的表型，而且其表型不稳定，特别是具有高转移潜能的癌细胞其表型更不稳定，这就决定了癌细胞异质性的特征。6体外培养的恶性转化细胞的特征应用人工诱导技术可培养出恶性转化(malignanttransformation)的细胞及恶性程度不同的转化细胞。恶性转化细胞同癌细胞一样具有无限增殖的潜能，在体外培养时贴壁性下降，可不依附在培养器皿壁上生长，有些还可进行悬浮式培养；正常细胞
34、生长到彼此相互接触时，其运动和分裂活动将会停止，即所谓接触抑制(contactinhibition)。癌细胞失去运动和分裂的接触抑制，在琼脂培养基中可形成细胞克隆，这也是细胞恶性程度的标志之一。当将恶性转化细胞注入易感生物体内，往往会形成肿瘤。对体外培养的恶性转化细胞及癌细胞的比较研究有助于了解癌细胞的特征及发生机制。二、癌基因与抑癌基因癌症是由携带遗传信息的DNA的病理变化而引起的疾病。与遗传病不同，癌症主要是体细胞DNA突变，而不是生殖细胞DNA突变。癌基因(oncogenes)是控制细胞生长和分裂的正常基因的一种突变形式，能引起正常细胞癌变。癌基因最早发现于诱发肿瘤的劳氏肉瘤病毒(Rou
35、sSarcomaVirus，属逆转录病毒科)。它携带Src基因，该基因对病毒繁殖不是必要的，但当病毒感染鸡体后可引起细胞癌变。后来人们发现在鸡的正常细胞基因组中也有一个与病毒Src基因同源性很高的基因片段。鸡体内的Src基因编码一种与细胞分裂调控相关的蛋白激酶。它不具有致癌能力，但由于它的发现源于病毒癌基因及其与病毒癌基因的高同源性，因而不恰当地称为细胞癌基因(cellularoncogene)或原癌基因(protooncogene)，但也以此表明该基因突变可能有致癌的危险。对多种致癌的逆转录病毒中存在的癌基因(voncogene)的研究，均导致正常细胞中原癌基因的发现，其中很多原癌基因的产物
36、都是细胞生长分裂的调控因子。反过来，在人的多种癌细胞中证实了这些基因发生了突变。逆转录病毒所携带的癌基因可能是由于这类病毒特殊的增殖方式而从宿主细胞中捕获的，由于碱基序列的突变导致所编码的蛋白产物超活化或失去控制，最终导致肿瘤的形成。目前已发现近百种癌基因。癌基因编码的蛋白主要包括生长因子(growthfactor)、生长因子受体、信号转导通路中的分子、基因转录调节因子和细胞周期调控蛋白等几大类型(表123)。当然，因突变而诱发癌症的基因还不只这些。细胞信号转导是细胞增殖与分化过程的基本调节方式，而信号转导通路中蛋白因子的突变是细胞癌变的主要原因。如人类各种癌症中约30的癌症是信号转导通路中的
37、ras基因突变引起的。癌基因的产物常常是正常细胞不表达、或表达量很少、或表达产物活性不能调控的一类蛋白。然而人们注意到，在视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)的细胞中，是由于一种称为只6的基因突变失活，而导致肿瘤发生。随后又发现p53等基因均有类似的现象。这类基因称为抑癌基因(tumorsuppressorgene)。抑癌基因实际上是正常细胞增殖过程中的负调控因子，它编码的蛋白往往在细胞周期的检验点上起阻止周期进程的作用。如果抑癌基因突变，丧失其细胞增殖的负调控作用，则导致细胞周期失控而过度增殖。通过细胞增殖相关基因和抑制细胞增殖相关基因的协同作用，共同调控细胞的正常增殖进程。肿瘤细
38、胞的基本特征之一是细胞增殖失控，恰恰也是这两大类基因的突变，破坏了正常细胞增殖的调控机制，形成了具有无限分裂潜能的B中瘤细胞(图123)。三、肿瘤的发生是基因突变逐渐积累的结果根据DNA复制过程中的基因突变率及人的一生中细胞分裂次数推测，在人的一生中，其基因组中每个基因都可能发生10-10次的突变。如果再考虑生活环境中的致癌因素(如辐射等物理因素，化学诱变剂等化学因素和肿瘤病毒感染等生物因素)，令人们感到惊奇的并不是细胞为什么会癌变，而是肿瘤的发生频率为什么如此之低。根据大量的病例分析，癌症的发生一般并不是单一基因的突变，而至少在一个细胞中发生56个基因突变，才能赋予癌细胞所有的特征，即癌细胞
39、不仅增殖速度快，而且其子代细胞能够逃脱细胞衰老的命运，取代相邻正常细胞的位置，不断从血液中获取营养，进而穿越基膜与血管壁在新的组织部位安置、存活与生长。因此细胞基因组中产生与肿瘤发生相关的某一原癌基因的突变，并非马上形成癌，而是继续生长直至细胞群体中新的偶发突变的产生。某些在自然选择中具有竞争优势的细胞，再经过类似的过程，逐渐形成具有癌细胞一切特征的恶性肿瘤。如直肠癌发生的病程中开始的突变仅在肠壁形成多个良性的肿瘤(息肉)，进一步突变才发展为恶性肿瘤(癌)，全部过程至少需要1020年或更长时间(图124)。因此从这一点上看，癌症是一种典型的老年性疾病，它涉及一系列的原癌基因与肿瘤抑制基因的致癌
40、突变的积累。图124直肠癌发生示意图在人的二倍体细胞中肿瘤抑制基因有两个拷贝，只要其中一个基因拷贝正常，便可保证正常的调控作用。如两个基因都丢失或失活，才能引起细胞增殖的失控，而原癌基因的两个拷贝中只要有一个基因发生突变，便可能起到与癌基因类似的作用。在某些癌症病例中，其生殖细胞中原癌基因或肿瘤抑制因子发生致癌突变，致使体内所有的体细胞的相应基因都已变异。在这种情况下，癌变发生所需要的基因突变数的积累时间就会减少，携带这种基因突变的家族成员更易患癌症。第三节真核细胞基因表达的调控原核细胞基因表达与调控在很大程度上取决于环境的诱导和对环境的适应，而对于真核细胞，特别是由数百种不同类型的细胞构成的
41、高等动植物，其基因表达与调控更多地表现在细胞分化和细胞“社会”的协同与稳定。过去，生物学家曾认为：“细胞分化伴随着某些遗传信息的丢失”。直到20世纪5060年代，随着一系列关键性实验，这一想法终被屏弃。实验表明，已经分化了的细胞仍保留着细胞全能性(植物)和细胞核全能性(动物)。例如，康奈尔大学的FSteward等证实了从成熟植物体上分离下来的单个细胞，在适当的条件下，经诱导能长成一株完全发育的植株，而且含有自然条件下正常植株所有类型的细胞。虽然来自成熟动物的单个细胞不能长成新个体，但实验表明这些细胞的核仍包含了发育成新个体的所有必要遗传信息。1997年，lanWilmut和他的同事们公布了第一
42、个克隆哺乳动物(Dolly羊)。为了完成这一目前备受争议的成果，他们准备了两种细胞：一种是去核的未受精的绵羊卵细胞，另一种是取自一头成年雌绵羊的乳腺并经过培养的细胞。去核卵细胞与乳腺细胞经电脉冲技术使其融合，该程序实质上是细胞核移植。其后，依靠来自新核的遗传指令，这个卵细胞就发育成一只健康的小羊。上述实验说明，分化细胞的核，无论是来自植物的根还是动物的腺体，都含有分化成许多不同类型细胞所必需的遗传信息。通常一个细菌细胞拥有足以编码大约3000种多肽的DNA，其中约有三分之一会在任何时间都会典型表达。与此对照，一个人的细胞拥有足以编码几百万种多肽的DNA(60亿bp)，尽管这些DNA中的大多数实
43、际上并不含有编码蛋白质的信息，但据估计，哺乳动物在其一生中还是能合成100000种不同的多肽。由此估计，一个典型的哺乳类细胞任何时候都在制造大约5000种不同的多肽。这些多肽的大部分，如糖酵解酶系和呼吸链中的电子传递体，实际上所有体细胞都能合成。与此同时，每种细胞又都在合成与分化状态相应的特有蛋白质。由于在真核细胞中，DNA信息量大，合成的蛋白质种类繁多，因此，真核细胞基因表达的调控是非常复杂的过程，而对它的深入认识可以说才刚刚开始。想象一下，从一个骨髓的多能造血干细胞发育成一个红细胞的情形。在红细胞的蛋白质中，血红蛋白(hemoglobin)占了95，但编码血红蛋白的基因在总DNA中还占不到
44、百万分之一。这就意味着细胞不仅要像大海捞针般地在染色体中找到必需的基因，而且对基因表达的调节必须达到高度精密的程度，以使这寥寥几种多肽的合成在细胞中成为占支配地位的活动。由于导致特定蛋白质合成的系列事件是由若干步骤组成的，所以真核细胞基因表达的调控是多级调控系统(multistageregulationsystem)，主要发生在三个彼此相对独立的水平上(图125)：转录水平的调控(transcriptional-levelcontr01)，决定某个基因是否会被转录，并决定转录的频率；加工水平的调控(processing-levelcontrol)，决定初始mRNA转录物(hnRNA)被加工为能
45、翻译成多肽的信使RNA(mRNA)的途径；翻译水平的调控(translational-levelcontrol)，决定某种mRNA是否会真正得到翻译，如果能得到翻译，还决定翻译的频率和时间长短。翻译水平调控图125真核细胞基因表达的不同调控水平示意图一、转录水平的调控(一)真核生物的转录激活正如原核细胞一样，差别基因转录(differentialgenetranscription)是一种重要的调控机制，在特定时间真核细胞通过差别基因转录选择性地合成蛋白质。许多事实表明，在胚胎发育的不同阶段，不同的组织以及暴露在不同刺激下的细胞，其表达的基因均不相同。近十年来，关于在特定细胞内，某些基因在其他基
46、因均无转录活性的情况下是如何转录的研究取得了很大进展。转录调控由为数众多的蛋白质即转录因子(transcriptionfactors)的作用所主导。这类蛋白质从功能上可分为两类：通用转录因子(generaltranscriptionfactors)，与结合RNA聚合酶的核心启动子位点结合；特异转录因子(specifictranscriptionfactors)，与特异基因的各种调控位点结合，促进或阻抑这些基因的转录。事实上，即使知道了一些转录因子的结构和它们与靶DNA序列之间的相互作用，有时仍不能勾画出它们调控机制的统一蓝图。有时单个基因可能被许多不同的DNA调控位点调节，而这些位点又与各种不
47、同的调控蛋白结合。另外，一个DNA结合蛋白又可联系周围的许多位点，从而控制许多不同基因的表达。基因转录水平的调控错综复杂，且受多种因素影响，包括转录因子与特异DNA序列的亲和力，及其与DNA邻近位点结合的转录因子之间彼此协同作用的能力。基因转录调控固有的复杂性可以通过研究单基因(以PEPCK基因为例)内部及周围DNA来说明。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)是葡萄糖异生作用的关键酶之一，在代谢途径中，将丙酮酸转化为葡萄糖。当久未进食，体内葡萄糖水平降低时，就会在肝细胞中合成此酶；相反，如刚消化了一餐高糖食品之后，该酶的合成明显下
48、降。PEPCKmRNA的合成水平是由多种不同的转录因子共同调控的，包括多种参与调节糖代谢的激素受体。探明PEPCK基因表达调控的关键在于：阐明为数众多的位于启动子内部的DNA调控序列即顺式作用元件(cis-actingelements)的功能；确定与这些调控序列结合的转录因子即反式作用因子(trans-actingfactors)；解释信号通路即应答选择性基因表达的激活机制。该基因最邻近的上游调控序列是TATA框，它是基因启动子(promoter)的一个主要元件，启动子位于基因上游的一个调节区，它与RNA聚合酶结合并调节转录的开始，TATA框是许多通用转录因子的装配位点(assemblysite)，这是RNA聚合酶转录真核基因至关重要的前提。除TATA框序列之外，另外两种启动子序列称作CAAT框和GC框，它们对RNA聚合酶起始一个基因的基础水平的转录往往是必需的。CAAT框、GC框与转录因子结合(如NFl和SPl)，存在于许多组织中并广泛参与基因表达调控。一方面TATA框决定转录起始的位点，另一方面CAAT框和GC框决定RNA聚合酶转录基因的效率。这三种普遍的启动子元件的位置见图126第1行现有两种被普遍采用的方法用于鉴定启动子区域上述特殊位点的功能，一是缺失作图法(deletionmapping)，这种方法要求制备基因启动子