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1、浙江理工大学硕士学位论文用于结肠癌个性化治疗的溶瘤腺病毒载体的构建：个性化治疗之一姓名：张立堂申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：刘新垣20080324浙江理工大学硕士学位论文用于结肠癌个性化治疗的溶瘤腺病毒载体的构建摘 要结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率在我国各类肿瘤中排在第五位，仅次于胃癌、肝癌、食管癌、肺癌等恶性肿瘤，并随着人们饮食结构的改变呈逐年上升趋势。结肠癌多发于中老年人群，但是，目前的研究显示，结肠癌的发病年龄渐趋年轻化，我国结肠癌患者的发病年龄平均在45岁左右，较欧美要提前15年，而青年癌症患者中结肠癌占237。基因病毒病毒疗法由于结合了病毒的
2、扩增能力和基因的杀伤作用，从而成为结肠癌生物治疗的研究热点。在运载病毒的筛选中，腺病毒载体以其宿主范围广、可感染分裂和非分裂细胞、高滴度、易纯化、外源基因装载容量大等优点，越来越广泛地被应用于肿瘤治疗。本课题组已经成功构建了溶瘤腺病毒ZD55系统，该系统由野生型腺病毒删除EIB55Kd基因改造而来，EIB55Kd蛋白在病毒扩增过程中负责拮抗p53。野生型腺病毒感染正常细胞会激活细胞内的p53途径，此时E1855Kd蛋白抑制p53，保证宿主细胞的存活，为病毒的复制维持提供一个稳定的微环境。而删除掉E1855Kd基因后，由p53诱导，机体迅速清除受ZD55感染的正常细胞，由于多数肿瘤细胞内均存在p
3、53途径缺失，ZD55系统能选择性的在肿瘤细胞内扩增。但是大多数腺病毒载体都存在靶向性差，毒副作用强等缺点，极大的限制了溶瘤腺病毒的应用。因此，进一步提高溶瘤腺病毒的靶向性，降低对细胞的毒性成为溶瘤腺病毒开发的关键。目前，提高溶瘤腺病毒靶向性的方法主要有两种：其一改变病毒的外壳蛋白，使病毒只能感染肿瘤细胞；其二调控病毒的增殖，使病毒只能在肿瘤细胞内复制。后者最常用的方法是修改病毒基因组，或是利用一些肿瘤特异性的启动子来调控病毒DNA的复制，使病毒只能选择性的在肿瘤细胞内增殖。以此理论为基础，我们利用癌胚抗原启动子替换ZD55的E1A的启动子，成功构建出溶瘤腺病毒ZD55CEA。CEA具有较强的
4、结肠癌特异性，是结肠癌诊断及预后的重要指标，研究显示结肠癌病人血清中CEA的含量高达60ngmL。为了进一步提高结肠癌的治疗效果，本研究将大肠癌负相关基因STl3插入溶瘤腺病毒ZD55CEA中，构建了携带STl3基因表达框的溶瘤腺病毒CEAE1AZD55E1BSTl3。和传统的杀伤基因相比，STl3的靶向性更为专一，目前的研究显示，各类肿瘤中只有大肠癌的发生与STl3的表达水平存在负相关性。我们针对ZD55CEA的靶向性及CEAE1AZD55E1BSTl3对不同细胞的杀伤效果作了体外试验，结果显示ZDCEA在结肠癌细胞内能够快速的增殖，而在正常细胞内4浙江理工大学硕士学位论文无明显变化，在CE
5、A非高表达的肿瘤细胞内增殖缓慢；CEA-E1AZD55E1BSTl3对结肠癌癌细胞具有选择性杀伤效果，而对正常细胞无毒害作用。CEAE1AZD55E1BSTl3的成功构建实现了结肠癌的个性化治疗目的，并为基因一病毒疗法的进一步精确化建立一个新平台。关键词：基因病毒治疗，ZI)55，CEA，STl3羔壁望墅妄鳖兰堡堂垡笙窒 ：The construction of oncolytical Adenovirus for uniquetherapy ofcolorectal cancerABSTRACTColorectal cancelis one of the most commonly occu
6、rred malignant t啪0rsne incidenceand modality rate udnkes top five of the most fatal cancers，whichpresents a rising硎year byyear conslStentIy、)l，lm elevation of human living standardColorectal cancer c0姗【IloIllyexist inme oId peoplehowe岷current data shows that patients sufferring from thistunlor getS
7、youngefand youngAs the average year is only 45，about 1 5 yearsyounger than the Europealls，觚doccupied 237ofall the tumors happened on the youthUncolytlcal adenovirus is the current hot spot of studying colorectal CanCer，s gene-viralmerapy for combining the replication effect of vires and the killing
8、effect of geneAmong a玎tlletranstemng VeCtors，adenoviral vector is frequently adopted for broad host、 capable of infectingd1V1ded and nondivided cells、high titre、easy to purify、largepackaging capacityOur te锄h嬲constructed an oncolytical adenovirus ZD55，whose E 1 B 55Kdgene is artificially deleted舶mwll
9、d type adenovirusProtein E1B 55Kd is in charge ofantagonizing p53，whose activation bvwild type adenovirus directly induce cell apoptosis，Wild type adenovirus makesuse of E 1 B，Kd proteln to antagonize p53 ensuring host cellsurviving,which sustains a harnlonvmlcr0。clrcumstancc for virus replicationWh
10、en E 1 B 55Kd gene is deleted，bodyrapidly cleallSup mfected normal ceils through p53 pathway leaving only tumoral cells for Shon of thispathwayBut most of oncolytical adenovirus are not satisfying because of their 10w ability tota唱et to cancer cdis and strong sideeffect in toxicity,which restricts t
11、heir application in tumorge tIl唧y So，improving the oncolytical adenovimsability of targeting to c觚cer cells withlower toxlclty ls crucialCurrently,there are main two methods toimproye the oncolyticaladenovirusability to target to CanCer cellsThe first strategy is to change the adenovirus，surfaceprot
12、elns to make the adenovirus replicate only in tumor cellsThe second strategy is to regulateme pmllt鼬0n of adenovirusModifying virus genomeor using some specific promot盯S intumor to regulate the replication of adenovirusgenome are the most convenient and e懿ctiVemethodsBascd on this theory,we replaced
13、 E 1 A promoter withCEA，suecessfully coIlStnlctedadeIl。vectIDr ZD55_CEACEA possesses high specificity in col。rectal cancer,whiCh isuSually6浙江理工大学硕士学位论文seemed as a cue for colorectal cancer diagnosis and prognosisData show that protein CEA levelCan amount to 60ngmL in the serum of colorectal cancer p
14、atientsAs Investigations show,making uSe of viral therapy simply has no makable effectsIn order to enhance the killing effectof colorectal CanCWe insert STl 3 gene into oncolytical adenovirus ZD55一CEA constructing abrand-new gene-viral therapeutic oncolytical adenovirus CEAE1A-zD55一E1BSTl3。Comparedw
15、ith traditional killing genes，STl 3 shows higher specificity in targeting,data shows that onlySTl 3 displays a negative correlation with colorectal CanCer among a virety of tumorsWe did alot of in vitro experiments focuSing on the targeting effect of ZD55-CEA and the killing effect ofCEAE1AZD55一E1BS
16、Tl3，in which ZD55一CEA replicate robust in colorectal tumorscompared wittl no obvious change in normal cell and moderate replication in CEAnon-expressing tumoral cells；CEA-EIA-ZD55-E1B-STl3 presents excellent killing effect,while no detectable damage Were found in normal cellsThe construction ofCEAE1
17、AZD55一E1BSTl3 achieves the goal ofunique therapyfor CanCer and lays a newplatform for accurate gene-viml treatmentsKey Words：Geneviral therapy；ZD55；CEA；STl37浙江理工大学硕士学位论文缩写AdAmpDMEMBSACEACsClEDTAFBSRkDaLBPCRZD55oNYX015ZD55CEASTl3英文全称adenovirus缩略词表AmpicillinDIAbeccoS Modified Eagle MediumBovine Serum
18、AlbuminCarcinoembyoinic antigenCesium Chlorideethylene diamine tetraacetie acidFetal bovine serumInverted Terminal RepeatKilodaltonsLuriaBertani culture mediumpolymerase chain reactionAdcnovirus with E l B 55Kd deletedCRAD with E l B 55Kd deletedCEA promoter replace E 1 A promoter of ZD55Suppression
19、 of tumorgenecity 1 38中文全称腺病毒氨苄青霉素DMEM培养基小牛血清白蛋白癌胚抗原氯化铯乙二胺四乙酸胎牛血清反向末端重复序列千道尔顿LB培养基多聚酶链式反应删除掉ElB55Kd的腺病毒E1B 55Kd缺失腺病毒CEA启动子替代ZD55 E1A启动子大肠癌负相关基因STl3浙江理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由
20、本人承担。学位论文作者签名：浓主龌日期：劲国年3月珥目浙江理工大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密口 ，在年解密后使用本版权书。不保密口学位论文作者签名： 涞王氅日期：D分 年月争日 嚣凳烈喘日日期：2砧年月乏争日浙江理工大学硕士学位论文1引言11结肠癌的治疗背景111结肠癌的传统疗法早期结肠癌的治疗主要依赖手术治疗以及放
21、、化疗。手术治疗在结肠癌发病早期具有很好的效果，但是针对中晚期结肠癌，手术操作效果不佳，术后局部复发率在20-40左右，5年内患者的生存率不足50t。单纯的手术操作不能完全清除结肠癌细胞，一部分残存的结肠癌细胞扩散到周围肠系黏膜中。为了消除手术后残留的肿瘤细胞，自70年代来，国内外学者就一直尝试应用放疗对结肠癌患者进行治疗。大量研究表明，术后放疗可以显著抑制复发病灶的生长。然而，放疗对机体损伤很大，射频所及部位的正常细胞大量死亡，局部组织甚至会产生灼伤。为了降低这种伤害，研究人员针对肿瘤细胞和正常细胞之问的差异，筛选不同的化疗药物治疗结肠癌。目前，应用的最为广泛的化疗药物为5氟尿嘧啶(5-Fu
22、)，不过单独应用5Fu往往不能获得预期的疗效。因此，研究人员将研究重点转移到结肠癌新辅助化疗药物的筛选、新的抗癌药物的联合应用上。最近，由罗氏公司生产的5Fu的更新换代产品希罗达广泛的应用在大肠癌的化疗中，它属于靶向治疗药物，对于晚期大肠癌有明显疗效，个别病例可使病灶明显缩小，甚至消失【21。其它用于肿瘤治疗的新型药物还包括奥沙利铂(Oxaliplatin，COHP)、亚叶酸钙(I)及拓扑异构酶CPT。研究显示，5Fu与COHP联合应用的疗效明显优于传统的5Fu+表阿霉素(EADM)联合化疗方案。5Fu联合CPT及COHP无交叉耐药反应，并表现出一定的协同作用。5Fu+CPT+Lv对直肠癌进行
23、治疗发现，给药后肿瘤治愈的有效率及病患的缓解率在各种化疗方案中排在前列【3】，在国内外已成为治疗晚期直肠癌的一线药物。112结肠癌常用的生物疗法结肠癌患者即便在施行根治性手术和辅助化疗后仍有较高的转移发生率，而肿瘤的转移是结肠癌患者死亡的直接原因【4】。该转移过程涉及多个基因分阶段的改变，包括启动，发展，扩散等多个步骤，在每个阶段都有癌基因的激活或抑癌基因的失活。单纯的放、化疗对机体损伤大，副作用强。而生物疗法以其特异性强，毒副作用小，激发免疫系统，靶基因矫正功能，有望成为未来结肠癌治疗的主导模式。目前，用于结肠癌生物治疗的主要策略包括：a增强机体抗肿瘤免疫b促进机体造血功能c诱导肿瘤细胞凋亡
24、d增强肿瘤细胞的敏感性e诱发细胞衰老抑制肿瘤血管生成。实际应用于临床的治疗方案可以细分为：浙江理工大学硕士学位论文乱细胞过继性免疫治疗b主动免疫治疗c应用细胞因子d病毒疗法e基因疗法基因病毒疗法。而在结肠癌的所有疗法中，病毒疗法、基因疗法以及基因病毒疗法是目前研究的比较成熟的，它们在结肠癌的生物治疗中最具有讨论价值。1121病毒疗法上世纪初，研究人员偶然发现肿瘤患者感染野生型病毒后，肿瘤的体积会发生缩减，病毒对肿瘤具有一定的杀灭作用【51。但是野生型病毒给药治疗副作用大，难以人为控制用量，生物安全度低，因此该操作方案一度被废弃。然而，基因工程的发展使得人为修改病毒基因组，增强病毒的肿瘤靶向性成
25、为现实，极大的提高了该疗法的安全性，使得病毒疗法再次成为人们战胜癌症的希望所在。最近，人们选取各种不同的病毒进行试验，筛选出了一大类对肿瘤具有杀伤作用的病毒，并对这些病毒的基因组加以改造，构建了靶向更高，杀伤效果更强的病毒载体，这一大类病毒载体以其相对特异的靶向作用又被称为溶瘤病毒载体。1990年到2004年间进行的1020项基因治疗方式的临床实验中，675项(66)是针对肿瘤的，而其中一半以上的是利用复制型病毒携带杀伤基因，这包括溶瘤腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、慢病毒等DNA病毒以及新城疫病毒和呼肠孤病毒两个RNA病毒【5】。病毒疗法是在保证野生型病毒的高感染率、高扩增率条件下，人为删除野
26、生型病毒本身所携带的某些致病基因，以提高生物安全度；或是修功删除某些表达病源识别蛋白的基因，以逃避机体的免疫识别，满足治疗需要的【5】。利用基因工程可以对这些病毒参与侵染、复制的基因进行修改以达到肿瘤治疗的目的，近来已有近十种增殖病毒进入临床研究，其中最引人注目的肿瘤特异性增殖型病毒是美国ONYX药物公司研究的ONYX015，它利用肿瘤细胞中p53基因突变而正常细胞中p53正常的差异使病毒达到特异性增殖。目前该病毒已进入III期临床试验。应用ONYX015与化疗结合使用疗效为63，这是至今为止应用于临床的最有效的生物治疗。但是，单用该病毒疗效甚微，有效率20，所以必须与毒副作用极大的放化疗联合
27、应用才能有效的杀伤肿瘤【61。病毒疗法依赖病毒本身的高度增殖能力和毒性作用来杀灭肿瘤，然而，病毒总是受一定的宿主范围限制，并对正常细胞表现出一定的毒性作用。此外，病毒载体本身的应用存在着很大的风险。目前常用的几种病毒载体都具有不同的应用缺陷：AdV在基因治疗中面临的最大挑战来自于宿主在Ad侵染后产生的较强免疫反应【7，引。免疫中和抗体不仅阻碍AdV有效吸附靶细胞，而且还可以诱导免疫系统清除已感染AdV的靶细胞，从而大大降低了外源基因的表达。AAv的低包装容量极大限制了其在基因治疗中的应用，10浙江理工大学硕十学位论文10410Scf-umL的病毒滴度亦难于应用于临床可复制型慢病毒的产生是慢病毒
28、诉诸临床的最大障碍【91，尽管要产生有复制能力的HW，必须在不同的质粒上发生多次非同源重组事件，目前的慢病毒载体系统只在包装结构中保留小于25的病毒基因，在载体结构中保留小于5的病毒基因【10】，即便如此用于人体试验时仍不能消除对其安全性的顾虑。1122基因疗法鉴于病毒载体本身的应用风险，人们开始寻求其他的方案来解决肿瘤的杀灭问题。目前，应用的较为成熟的是肿瘤基因治疗手段。基因治疗以其良好的肿瘤杀灭功能成为结肠癌治疗的重要备选方案。众所周知，肿瘤细胞和正常细胞在基因组的表型上存在很大的差异，正常细胞内的某些基因，特别是癌基因和抑癌基因的突变，是导致癌症发生的主要原因【111。现有的证据显示肿瘤
29、发生是一个多步骤的过程，其中包括多种肿瘤抑制基因的突变和原癌基因激活。研究人员利用肿瘤细胞与正常细胞在基因表达上的差异，选择性的将外源治疗基因或杀伤基因导入肿瘤细胞内，从而将肿瘤细胞阻滞在不同的细胞周期，或者诱发肿瘤细胞的全面凋亡。研究显示，目前所有应用于肿瘤治疗的各类方案中应用得最多的为抗体基因，细胞因子及肿瘤抑制因子三大类(表1)。表12007年用于临床治疗的各种基因及其在临床应用中所占的比例相关数据来源于Wiley数据库wwwwileyeoukgenmedelinical治疗基因 临床治疗数(例) 在各种治疗中所占的百分比Antigen 266 203Cytokine 247 189Tu
30、mor surpressor 157 12Growth factor 107 82Suicide 107 82Receptor 67 51Deficiency 103 79Marker 54 41Replication inhibitor 48 37Other categories 115 86Unknown 38 29浙江理工大学硕士学位论文结肠癌细胞的发展具有典型的恶性肿瘤特征，最明显的表现就是P53途径的缺失。P53基因是一种重要的肿瘤抑制基因，它的表达缺失会使大肠膜系正常细胞迅速恶化为肿瘤细胞。以P53基因为靶标应用Ad5CMV-p53治疗转移性结肠癌时发现，WB2054M5移植瘤的生
31、长速度大为减缓，治疗四周后瘤体体积为O75+-026锄3(pO001)，而PBS和Ad5CMV组的瘤体体积分别为166+-043crn3，140+-047crn3；4周时Ad5CMV-p53注射组的瘤体体积发生轻微上调，PBS，Ad5CMV对照组的瘤体体积则迅速增殖至441+-088和393+-186(p0001)12】。除了P53外，杀伤基因kallistatin也被应用在HCT-116移植瘤的治疗中，kallistatin表达谱广泛，肿瘤胞内表达kallistatin能够显著的抑制由血管内皮细胞生长因子和成纤维生长因子诱发的血管增殖。HCT-116小鼠移植瘤内注射2x1011rAAV-KA
32、L后，肿瘤生长被抑制78以上，注射21天后进行检测发现，瘤体体积为171 4-52 mlTl3，而注射PBS对照组的体积则上升为776 4-241 nlnl3。与此同时研究人员还发现微血管的密度发生显著的降低，肿瘤细胞的扩增率大为延缓，鼬67阳性细胞所占比例降低至最低【131。1123基因病毒疗法诸多研究显示，单纯的病毒疗法或基因疗法难以达到预期的治疗效果，为了解决该问题，科研人员采用了肿瘤的基因病毒疗法。基因病毒疗法结合了病毒疗法和基因疗法的双重优越性，并表现出很强的协同效应，体外及动物体内的研究结果显示，肿瘤基因病毒治疗的疗效明显优于单一的溶瘤病毒治疗和传统的基因治疗的疗效【141。其主要
33、原理是利用肿瘤细胞与正常细胞在基因表达谱上的差异，人为改造病毒，使改造后的肿瘤增殖病毒具有特异性地在肿瘤细胞内增殖复制并溶解破坏肿瘤细胞的能力，而在正常细胞几乎不增殖。以这些肿瘤增殖病毒为载体，将抗肿瘤基因插入增殖病毒的病毒基因组中，随着病毒在肿瘤细胞内的增殖，抗肿瘤基因的拷贝数在肿瘤细胞内数千倍扩增，从而数百倍的高效表达抗癌基因，病毒及抗癌基因两者协同达到明显抗肿瘤疗效。这种新型基因病毒治疗结合了病毒治疗与基因治疗双方的优点，克服了传统基因治疗转染率及目的基因表达量低的不足，也克服了肿瘤增殖病毒杀伤力低的缺点，目前基因病毒治疗在动物体内已产生明显的抗肿瘤疗效，是一种新的突破，并已经建立肿瘤基
34、因一病毒治疗系统的生产、纯化工艺及临床前研究质控标准。病毒载体转基因治疗存在一些必须克服的问题：载体系统转染效率低目的基因表达量低基因操作难、病毒滴度低残存的野生型病毒感染静止细胞。因此，构建、筛选12浙江理工大学硕士学位论文具有肿瘤特异性，对正常细胞无毒性、非致病性、有效的溶瘤病毒直接杀伤肿瘤成为未来病毒疗法的重点。因此选择合适的载体体系成为基因病毒治疗急待解决的问题。12用于结肠癌治疗的溶瘤腺病毒载体121溶瘤腺病毒的基本特征腺病毒具有典型的二十面体病毒壳体【15】。构成病毒壳体的蛋白主要有三种：六邻体(II)，五邻体基底(III)和纤突()。除了这些主要组成蛋白外，病毒还含有其他一些辅助
35、蛋白如VI，VIII，IX，Ilia和Iva2。腺病毒的是双链DNA病毒，其5端上存有一个末端反向重复序列(ITRs)，并结合着一种末端蛋白(TP)，腺病毒核心位置由病毒DNA和核心蛋白VII及mu小肽组成的复合物所占据【161。另一种蛋白V嵌合在该DNA蛋白复合物上，并由蛋白VI介导该复合物与病毒壳体间的空间联结【171。腺病毒本身还有一种独特的编码蛋白酶1s-20】，这种蛋白酶是病毒成熟和具有侵染性的决定因素。溶瘤腺病毒由野生型腺病毒改造而来，溶瘤腺病毒又称肿瘤细胞特异性增殖病毒，在肿瘤治疗中极具前景，它具有选择性地在肿瘤细胞内增殖、在肿瘤问自行扩散的优点，且同现有的治疗手段无交叉耐药作用
36、2I,22】。腺病毒本身所具有的这些特性决定了它能够被广泛的应用为基因携带载体。目前的研究也显示利用溶瘤腺病毒治疗肿瘤具有其他病毒难以企及的优越性。122溶瘤腺病毒的选择原则到目前为止，已有十余种不同类型的选择性增殖型病毒进入临床试验，其中包括选择CRAD、HSV、痘苗病毒、呼吸道肠道过滤性病毒及新城疫病毒，基于不同的应用目的，研究人员在选择载体体系时，常从如下几个方面考虑：宿主细胞的类型；病毒载体在细胞内的复制特性；载体的安全性；病毒所能获得的最终效价，以满足治疗的需要。而溶瘤腺病毒载体由于诸多优点成为基因治疗中最常用的病毒载体：宿主领域广，人类为Ad的天然宿主；Ad在体内可保持基因组自身线
37、性结构的完整性，不整合到细胞染色体上，以附加体形式存在；Ad蛋白的表达独立于宿主细胞的繁殖周期，不区分休眠期及分裂期；Ad没有包膜，不易被补体所灭活，可直接体内应用：病毒的效价高；Ad疫苗长期应用未见明显副作用，Ad仅能引起人呼吸道轻微炎症，无致癌威胁，具有较高的生物安全性。腺病毒本身的生物学特性赋予了它作为基因携带载体的天然优势，目前的许多研究和试验也证实了腺病毒载体确实具有良好的临床应用价值。浙江理工大学硕十学位论文1221非复制型溶瘤腺病毒最早用于基因病毒治疗的溶瘤腺病毒均为非复制型腺病毒，这些病毒载体中的野生型病毒复制依赖性基因被删除，包装获得的病毒只能应用一次。非复制型溶瘤腺病毒的研
38、究历经了三代：第一代腺病毒载体删除了野生型病毒基因组的E1(或部分E1A)和(或)E3区【矧(图2)。它可以插入65kb的外源基因，去除El阻止了依赖E1和E2区功能蛋白的转录和随后病毒DNA复制及病毒壳体蛋白的产生，但是其增殖必须在能够反式提供El区表达蛋白的感受态细胞中完成。目前可以提供El区表达产物的细胞株有：293，911，N52。E6和PER(26。第一代重组腺病毒载体较多的保留了野生型病毒的习性，细胞导入效率高，病毒滴度大。其最大缺点是免疫原性较强，由于病毒包壳未加改造，人体对其拥有天然抵抗力，致使腺病毒载体携带的外源基因表达时间短暂。此外许多类型的细胞都含有允许E2基因表达的El
39、样蛋白，增加了产生可复制腺病毒(replicative compotent adnovirus，RCA)的风斛241。鉴于第一代载体的应用缺陷，研究人员对病毒的基因组作了进一步改造，去除了病毒的E2A，E2B和(或)E4区域(图2)，将产生RCA的可能降至最低24】，并使载体包装容量扩大至14kb。然而，与第一代腺病毒相比，第二代腺病毒仍然不能避免残余病毒基因表达物在体内的免疫反应和细胞毒性【251。为了进一步提高病毒载体的包装容量，有学者设计了第三代腺病毒载体。第三代腺病毒载体又被称为空壳腺病毒载体或无肠腺病毒载体(gutless adenovirus vector)，该载体剔除了全部病毒基
40、因组，只保留了ITR和包装信号、I，使包装容量达到36kb2627】(图1)。Zou等将空壳腺病毒注入大鼠右侧海马回，转染中枢神经细胞。由于空壳腺病毒致病蛋白表达缺失，使得给药所引起的肌体免疫反应和细胞毒性降至最低，携带基因表达时间长达66天【2引。曰o弱卫辩黼 一 卜基本绷q_- 一Ll L2 L3 U U第-玳AEl0撕) 士泖l曲) 第二代El 士AE2b士AE2a士A E3士AE4(3狮 (1，s坳(16坳(3蚴(2 s坳第三代图I复制缺陷型腺病毒的改造：腺病毒基冈组编码区由早期基因ElE4，晚期基因LlL5组成，前者编码调节蛋白，后者编码结构蛋白。El所表达的蛋白是腺病毒复制、包装和
41、其后蛋白表达的基础，三代复制缺陷型病毒均将其剔除，以降低产生RCA的可能，减少细胞毒性。ITR是复制起点并调控病毒的复制和包装，其内侧为病毒包装信号(、l，)。第一代复制缺陷型病毒表现为El+E3(AEI)；第二代E I土E3+E4(AE 1 AE4)，E I+E3+E2(AE 1 AE2)：第三代将病毒基因全部删除，只保留ITR和、I，。14浙江理丁大学硕士学位论文1222复制型溶瘤腺病毒复制缺陷型溶瘤腺病毒只能转染一次细胞，不发生自主扩散。随后构建的溶瘤腺病毒成功的解决了该问题，在保留E1A等复制必须的早期基因基础上，进一步修改病毒基因；替换组织或肿瘤特异性启动子；改造病毒包膜蛋白将病毒的
42、扩增限定在肿瘤细胞中。肿瘤细胞溶解后能释放肿瘤抗原，提呈给树突状细胞(DC)和T细胞进行识别，诱发抗肿瘤免疫重建。常用的一些溶瘤腺病毒如表2所示。表2常见溶瘤腺病毒类型 溶瘤腺病毒修改基因 CNHK200，CNHK300(Ad-TERT)，CNHKS00，CNHK600，d11520，24，d1922947，Adv-TERTp-E1A，ZD55替换启动子 LFIRE-E1A-ZD55，CEAEIA-ZD55，AFP-E1A-ZD55， SurvivinE1A-ZD55，Ad9xHREIA，HYPR-Ad，Ar6pAE2fE3F，ONYX-41 1，AdE2F1Rc，01PEME，AdEHT2，
43、AdEHE2F，AdDF3El，AdhOCE1，CV-787，CV二764，CN706，A，Ela04i，CV890，AdTyrwt，AdTyr A 24，AdTyr A 2 A 24，KDISPB，Vcfl 1，AdMKEI，AdE3IAI3B改造外壳 Ad53 A24溶瘤腺病毒是目前基因病毒治疗的主要应用载体，大有取代非复制型溶瘤腺病毒的趋势，溶瘤腺病毒病毒本身的高增殖性使得用于治疗的病毒量大为降低，避免了反复给药操作引起的机体耐受和疗效降低问题。研究发现ZD55MnSOD联合5FU体外针对SW620细胞进行试验时，SW620细胞对该联合疗法的敏感性要高于单独应用ZD55MnSOD或5-F
44、U，而受试细胞的凋亡率远远高于非复制型腺病毒AdMnSOD。体内试验发现，模型小鼠结肠癌移植瘤的增长幅度显著降低，给药小鼠的存活时间大为延长【29】。123溶瘤腺病毒的改造方案溶瘤腺病毒通常通过如下两种方案进行分子改造：其一选择性缺失病毒在正常细胞复制必需而在肿瘤细胞中非必需的基斟51，这些基因包括腺病毒的E1A基因及E1B基因，它们负责拮抗正常细胞内的Rb或p53，Rb和p53能够诱导受病毒感染细胞的凋亡，肿瘤细胞内由于Rb或p53途径缺失不会发生凋亡，从而为外来病毒的复制增殖提供了一个稳定的微环境。这种改造后的增殖病毒在动物实验中疗效显著，并已进入临床试验，经典的如美国ONYX药物公司研制
45、的E1B55KD缺失的ONYX01561，其联合常规化疗(5Fu、顺lS浙江理工大学硕七学位论文铂)治疗30例复发的头颈部肿瘤患者，临床有效率可达63，但作为单剂治疗疗效仅在20左右，可能同E1B基因同时也参与晚期mRNA转运出核的过程这一特性有关。另一改造策略是利用组织或肿瘤特异性启动子【3们，如AFP、MUCI，PSA及pS2等，来调控腺病毒增殖的必需基因，这种改造后的病毒在动物实验中非常成功，前列腺肿瘤特异性增殖型腺病毒CN706及CV-787已进入临床试验【301。13结肠癌个性化生物治疗131大肠癌肿瘤特异性启动子的筛选结肠癌细胞不但具有恶性肿瘤的一些共有特征，还具有一些其他肿瘤不具
46、备的独有特征，例如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的过表达【311。CEA是一种人类胚胎抗原的酸性糖蛋白，在多种细胞内均存在表达。正常细胞内CEA的表达水平很低，分泌到血清中的CEA常常低于5ngmL，而发生癌变的细胞内CEA则存在显著上调，病人血清CEA检测可以高达60ngmL。高浓度的CEA与结肠癌的发展相关，常被用来作为结肠癌早期癌变的重要检测指标，不过必须指出的是并非所有CEA高水平表达细胞都是肿瘤细胞或是具有癌变趋向的细胞，研究发现肠梗阻、胆道梗阻、尿毒症、胰腺炎、肝硬化、结肠或直肠息肉、局限性肠炎和溃疡病患者中，25的人血清CEA可暂时升高。事实
47、上，不同肿瘤细胞内CEA的表达情况也不尽相同，结肠直肠癌、胃癌、胰癌、肝细胞癌、肺癌、乳癌以及甲状腺髓质癌中均存在CEA的高表达，绒毛膜癌、骨癌、前列腺癌和卵巢癌中也存在一定水平的表达，而在其他一些肿瘤细胞内CEA的水平和正常细胞相比并不存在统计学意义上的区别。CEA的表达具有一定的结肠癌特异性，以此为基础，研究人员将CEA的启动子单独分选出来，构建了由CEA启动子启动外源杀伤基因表达的载体，由于结肠癌细胞内存在着利于CEA转录的氛围，使得外源基因能够高水平表达f321。而正常细胞内由于不存在这种氛围，CEA的转录起始功能受抑制，无法实现预期的外源基因高表达，从而使得杀伤基因只选择性的杀灭结肠
48、癌细胞，而对正常细胞无影响。尽管这种特异性是相对的，采用基因疗法进行治疗时可能会杀灭一些发生炎症的正常细胞，以CEA启动杀伤基因表达仍然不失为一种理想治疗策略。许多前期细胞试验以及动物试验都表现出良好的治疗效果。以CEA启动自杀基因HSV-tk和ECCD构建表达质粒pCEAtk和pCEACD。然后分别与pSV2neo共转染结肠癌细胞株LoVo和宫颈癌细胞株Hela，与野生型LoVo细胞相比，LoVoCEAtk和LoVoCEACD对GCV和5-FC的敏感性分别提高2000倍和700倍，而HelaCEAtk(或HeIaCEACD)对GCV(或5FC)贝I|3F敏感【33】。16浙江理工大学硕士学位论文132大肠癌负相关基因的筛选大肠癌的发生是一个的多基因参与、多步骤及多阶段的分子模式，如DNA甲基化水平变化、rag激活、myc扩增、APC和p53突变等。近年来随着分子生物学研究的飞速发展，该模型也不断得到补充，现已明确包括癌基因、抑癌基因、错配修复基因以及细胞周期调控相关因子突变等一系列积累，形成了恶性肿瘤发生发展的基础。但这些基因仍不足以解释肿瘤的发生、发展的全过程，在