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1、烟草内生细菌YN202248的定殖能力研究 1.2 方法 1.2.1拮抗细菌YN202248的GFP标记解淀粉芽孢杆菌YN202248的自然转化，采纳Idris等12供应的两步法。将转化胜利的菌株经不含卡那霉素的 LB 培育液和平板交替接着培育5轮，再回接到含卡那霉素的LB平板上检测，以证明其质粒表达的稳定性。 1.2.2 GFP标记菌株与YN202248野生菌株拮抗实力的比较测定采纳平板对峙13试验比较GFP标记菌株和野生型YN202248菌株对植物病原真菌的室内拮抗活性，其中植物病原真菌以烟草黑胫病病菌、禾谷镰刀病菌、玉米弯孢霉叶斑菌、番茄枯萎病菌、稻瘟病菌等为试验材料。当空白比照的病原菌
2、长满平板时，视察接种拮抗菌的培育皿中拮抗带宽度的改变，对比两者的拮抗带宽度，得出标记菌是否具有相同的拮抗实力，以此来推断其是否适用于定殖和生物防治探讨。 1.2.3 GFP标记菌在烟草体内外的定殖探讨浸种处理：云烟101种子经酒精消毒后，用标记菌菌悬液浸泡24 h，取出种子，用灭菌水冲洗4次后置于垫有潮湿滤纸的培育皿内，于28光照培育箱中保湿培育。种子发芽后取0.5 g幼苗，用酒精消毒后，再用无菌水冲洗4次。将植物组织研磨成浆状物，并稀释成不同浓度，静置3 min。取150 L汁液涂抹于含20 g/mL卡那霉素的LB平板上，28 下黑暗培育48 h，在紫外投射仪照耀下统计平板上发绿色荧光的菌落
3、数，计算含菌量。以清水浸种为比照，每处理重复3次。 灌根处理：将长势一样的56片真叶期的烟草苗根拔起洗净后移栽在装有未灭菌自然土的花盆中后，用GFP标记菌菌液灌根处理。分别于处理后第1、5、10、25、50天取样，测定拮抗细菌在烟草根、茎、叶内的定殖状况。以烟草根灌清水为比照，每处理重复3次。在组织分别的同时，称取烟草根际土于无菌水中，摇床震荡30 min后，进行一系列梯度稀释后涂布在含有卡那霉素的LB平板上，测定标记菌在根际土中的菌落改变状况。选择处理1d和10 d后的烟草样品，切取用无菌水清洗过的烟草根、茎组织，压片法制片，在激光共聚焦显微镜下视察GFP标记菌株在烟草体内的定殖状况，以不接
4、菌的烟草植株作为比照。 2 结果 2.1 解淀粉芽孢杆菌YN202248的转化 根据Idris等12供应的方法，我们胜利地将pGFP4412质粒导入解淀粉芽孢杆菌YN202248自然感受态细胞中。pGFP4412标记的YN202248荧光明显，在抗生素平板上肉眼可见浅黄色菌落，其在紫外投射仪下菌落发出光明的绿色荧光，转化菌株命名为48-pGFP。48-pGFP经不含卡那霉素的LB培育液和平板交替接着培育5轮，再回接到含卡那霉素的LB平板上能正常生长，且绿色荧光光明，说明标记菌株质粒能稳定表达。 2.2 48-pGFP与野生型菌株室内拮抗活性的比较 在平板对峙试验中，与YN202248菌株的野生
5、型相比较，48-pGFP菌株对病原真菌烟草黑胫病病菌、禾谷镰刀病菌、玉米弯孢霉叶斑菌、番茄枯萎病菌、稻瘟病菌等的拮抗实力与野生型的相同。说明标记后菌株对病原菌的抑制作用未受到影响，适用于定殖和生物防治的探讨。 2.3 48-pGFP在烟草体内和体外的回收监测 在浸种处理的试验中，清水比照处理中回收不到菌落，而用48-pGFP处理后长出的烟草幼芽中可以回收到1.07104 cfu/g发荧光的菌落。灌根试验的结果如图3所示，在根际土、根、茎、叶中，随着移栽后时间的延长，标记菌株的定殖密度有所下降。在用48-pGFP菌液处理后的第1天，在根、茎和叶组织中回收到的菌落数分别为8.59105、3.351
6、05和7.44104 cfu/g，在第5天时菌落数有所下降，到第10天时处于上升状态，之后起先下降，到第50天时，烟草根、茎和叶组织中仍回收到2.53105、4.10 102和4.44102 cfu/g的菌落。烟草根际土中的前10 d，48-pGFP处于缓慢增长的状态，到第10天时根际土中回收的菌落数达1.66107 cfu/g，之后渐渐下降，到第50天时回收到的GFP标记菌为2.00105 cfu/g。在处理后第25天对烟草组织进行表面消毒和不消毒处理后发觉，表面消毒过的只有未表面消毒的烟草组织中菌落数的1/10，说明YN202248菌株在植物表面也能够大量定殖。在处理第50天后烟草各组织和
7、土壤中回收的48-pGFP菌落在抗生素平板上形成的菌落成浅黄色菌落是肉眼可见的，在紫外投射仪下能看到明显的荧光，说明GFP标记菌株比较稳定。处理后的第1天，48-pGFP在烟草根系上的定殖状况如图5a所示，在激光共聚焦显微镜下可以清晰的看到经过48-pGFP处理的根表呈现出很强的绿色荧光，比比照烟草根系中微弱的自发荧光强得多；在茎组织切片中有标记菌的踪迹，且48-pGFP主要聚集在茎的表皮和皮层部位。在处理后的第10天，烟草根表的绿色荧光信号更加剧烈，与分别培育检测菌落数结果相符，同时在茎的维管组织细胞中也能检测到48-pGFP。 烟草组织中标记菌落的回收结果和荧光显微镜视察结果都表明，48-
8、pGFP能够进入烟草植株内部，并在烟草体内传导。菌株在进入到茎组织后，首先在表皮和皮层上定殖，然后向上传输到达叶片中，同时已定殖在表皮和皮层上的标记菌株也会向茎内部的维管组织中横向移动。烟草根际土中菌落回收结果表明，48-pGFP能在土壤中很好的定殖。由此表明，48-pGFP能够很好的在烟草体内外传导和定殖。 3 探讨 植物内生细菌作为新挖掘的微生物资源，正在被广泛开发利用，相对于其他植物来说，烟草内生菌探讨及开发较少，其应用潜力巨大14。内生有益细菌在其寄主或其他植物中稳定定殖是其发挥防病促生作用的重要前提15-16。目前已有很多探讨生防菌在植物体内定殖状况的方法，其中GFP标记具有操作简洁
9、、检测便利、无需外源底物等优点，已经成为当代探讨目标微生物在自然环境中的释放、生存、定殖以及与其他微生物或植物互作等最为胜利的报告基因11，17-19。YN202248是一株具有促生长、防治烟草黑胫病的烟草内生细菌20-21。本试验以GFP胜利地标记了该菌株，从而为探讨其在烟草植株不同部位的分布状况、定殖规律、促生长和防病机制供应了有力工具。 以标记菌株48-pGFP浸种和灌根处理，证明48-pGFP能在烟草体内定殖，灌根处理时，它在烟草根、茎、叶内的定殖实力为：根茎叶，表明该菌株进入烟草苗的根系后，能够转移到植株的茎和叶部组织。定殖数量动态在烟草的根、茎、叶等组织中均呈现“减-增-减”的改变
10、趋势，且在根内的数量改变明显比茎和叶内的平缓，此结果与前人在其他作物上进行的定殖探讨结果一样22-24。生防菌在根部定殖实力的强弱确定着生防的成败6，有益内生细菌B9467在小麦体内，固氮菌DX120E25在甘蔗体内均能很好定殖，但只有当定殖达肯定数量时，才能有效阻挡病原菌侵染植物。本探讨中48-pGFP在烟草体内的定殖随着植株的生长有所削减。因此，为了更好地发挥其防病促生长作用，在实际应用中可以依据须要适当补施，来保证YN202248在烟草体内的定殖菌落数。由于菌株经过GFP标记不能在大田中做相关试验，为了接近大田生长状况，本试验采纳未灭菌的自然土来做定殖探讨，表明野生型菌株YN202248
11、亦能在自然土中很好定殖。 4 结论 本探讨获得了烟草内生解淀粉芽孢杆菌YN202248的GFP标记菌株48-pGFP，并通过对峙试验证明标记菌株对5种病原真菌的拮抗实力与野生型菌株的相同，用48-pGFP菌液对烟草进行浸种和灌根处理，均能回收到标记菌株，表明YN202248能在烟草体内外很好的定殖，具有进一步开发成植物生防制剂或促生菌剂的潜力。 致谢：感谢中国农业高校植物病理系王琦教授无私地惠赠带卡那霉素抗性基因的质粒pGFP4412。 参考文献 1 Siciliano S D， Fortin N， Mihoc A， et al. Selection of specific endophyti
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