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1、好氧反硝化菌AD-1处理大豆乳清废水厌氧出水的性能评价 摘要：为了提高污水中氮素的去除效率，本探讨自某高校微生物试验室开发的处理大豆乳清废水厌氧出水的CAAC(Continuous Aerobic-anaerobic Coupled)反应器污泥中筛选出1株高效好氧反硝化菌AD-1，经 16S rDNA序列同源性比较和系统发育分析初步鉴定为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。通过摇瓶批次培育考察菌株AD-1对以硝酸盐为唯一氮源的DM反硝化培育基的脱氮性能。48h 时AD-1的TN和NO3-N去除率分别达到63.31%和63.35%，NON浓度虽始终处于较低水平却呈凹凸波动状态，
2、培育后期CODcr /TN下降是限制AD-1反硝化效率的主要因素之一。AD-1处理大豆乳清废水厌氧出水时NON去除率接近101%，具有较高效的反硝化特性。结果表明，该菌株可作为处理大豆乳清废水厌氧出水及其它含氮废水的生物强化剂。 Abstract: To increase nitrogen removal efficiency, the study screened a high-efficiency aerobic denitrifier AD-1 in the activated sludge originated from a university previous designed C
3、AAC(Continuous Aerobic-anaerobic Coupled)reactor treating SWWAE(Soybean Whey Wastewater Anaerobic Effluent). The strain was identified as pseudomonas putida according to the 16S rDNA sequence homology comparison and phyletic evolution analysis. The denitrification efficiency of Pseudomonas putida AD
4、-1 was analyzed in DM medium feeding nitrate as the sole nitrogen source by shake-flask batch culture. After 48h the TN and nitrate removal rate reached 63.31% and 63.35%, respectively. Nitrite concentration was always at low level but fluctuated. At the later culture stage the low CODcr/TN ratio wa
5、s one of main rate-limiting factors. AD-1 had high-efficiency denitrification with 101% nitrate removal rate in the process of treating SWWAE. Results indicated that AD-1 was a good bioaugmentation agent for SWWAE and other nitrogenous wastewater treatment. 关键词：大豆乳清废水厌氧出水；好氧反硝化菌；恶臭假单胞菌AD-1；硝态氮还原酶系；亚
6、硝态氮还原酶系 Key words: SWWAE(Soybean whey wastewater anaerobic effluent)；aerobic denitrifiers；pseudomonas putida AD-1；nitrate reductase；nitrite reductase 中图分类号：G31文献标识码：A文章编号：1016-431111-0008-03 0引言 脱氮始终是水环境污染治理中的一大难题，随着大豆深加工业的发展，大豆深加工乳清废水的排放量与日俱增，乳清废水中含有的大量CODcr、NH3-N、NO、NO难以刚好、有效地处理，由此引起的水体富养分化及养殖水产动物
7、中毒等现象日趋严峻。作为目前公认的废水脱氮处理中最经济、最有效的生物脱氮技术成为探讨的热点1,2。传统生物脱氮采纳好氧硝化-厌氧反硝化组合工艺，硝化作用在好氧的条件下将氨转化为NO/NO，反硝化作用在无分子氧的条件下利用有机物作为碳源，NO/NO作为能量代谢中的电子受体，O2-作为氢受体，合成自身物质或生成N2和H2O，进而达到脱氮的目的。大量的厌氧反硝化菌如Achromobacter, Aerobacter, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Lactobacillus和 Pseudomonas3等只有在缺氧或厌氧条件下反硝化基因得以表达，但
8、是其代谢缓慢，脱氮效率低，并且好氧菌与厌氧菌的空间分别培育也增加了脱氮工艺的成本4,5。而好氧反硝化菌和好氧反硝化酶系的发觉极大推动了生物脱氮的探讨，并受到国内外学者的广泛关注6,7。AD可以在有氧条件下以有机物为电子供体，并且同时以O2和NO/NO为电子受体，产生氮气。目前已报道的好氧反硝化菌有Alcaligenes faecalis, Citrobacter diversus, Pseudomonas stutzeri和Thiosphaera pantotropha等8,9,10。AD可以在同一空间内实现同步硝化-反硝化，避开了系统运行过程中pH的调整，节约了污水处理系统运行成本，而且克服
9、了厌氧反硝化菌生长缓慢，脱氮效率低的缺点11,12，为高浓度含氮废水的处理供应了一条新途径。 某高校微生物试验室前期设计开发了处理大豆乳清废水厌氧出水的CAAC反应器13，由移动床生物膜反应器和好氧-厌氧耦合反应器串联组成，反应器在室温条件下稳定运行近一年，CODcr去除率大于95%，TN去除率高于80%，具备良好的脱氮性能。本探讨从中筛选出1株高效好氧反硝化菌，通过16S rDNA方法鉴定菌株的种属关系，并通过摇瓶批次培育分别考察菌株AD-1对以硝酸盐为唯一氮源的DM培育基和大豆乳清废水厌氧出水的反硝化脱氮性能，以期更好地服务于含氮废水的工程应用。 1材料与方法 1.1 培育基SM培育基：柠
10、檬酸钠8.5g，NaNO30.85g，KH2PO41.36g，2SO40.27g，Yeast extract 1 g，MgSO4•7H2O 0.19g； 溴一百零一里酚蓝培育基14：L-天冬酰胺 1g，NaNO31g，KH2PO41g，FeCl2•7H2O 0.05g，CaCl2•2H2O 0.2g，Mg2SO4•7H2O 1g，BTB1 mL，琼脂20 g，pH7.07.3；LB液体培育基： Yeast extract 5g，蛋白胨10g，NaCl 10g；DM培育基：KNO3 0.6g，KH2PO4 1g，MgSO4•7H2O 1
11、g，柠檬酸钠 9.63g。 1.2 试验方法 1.2.1 好氧反硝化菌的富集、分别及脱氮性能测定污泥取自北京理工高校生命学院微生物试验室运行的处理大豆乳清废水厌氧出水的CAAC反应器。投加4g污泥至101mL SM培育基中，置于30，173rpm摇床中进行好氧反硝化菌富集培育。48h后取出4mL菌悬液至101mL簇新SM培育基中在相同条件下培育，如此重复3次。将菌悬液梯度稀释后涂布于BTB平板培育基中，置于30培育箱中培育至长出单菌落，挑取蓝色单菌落划线于LB固体斜面培育基，4保存。挑取已保存菌落接种至50mL LB液体培育基中，30、173rpm振荡培育14h。取4mL菌悬液接种于101mL
12、 DM培育基中，30、173rpm振荡培育，每12h测定NO3-N、NO2-N、TN及CODCr浓度。 1.2.2 好氧反硝化菌的鉴定菌株总DNA的提取和纯化参照文献15。以基因组DNA为模板，采纳细菌16S rDNA通用引物中，大豆乳清废水厌氧出水的主要成分分析见表1。30，173rpm振荡培育，每12h测定NO3-N、NO2-N及TN含量。 1.2.4 分析方法主要指标分析方法16CODCr采纳HJ/T 3101-2022快速消解分光光度法测定；TN采纳GB-T 11894-89碱性过硫酸钾紫外分光光度计法测定；NH4-N采纳氨敏电极法测定；NO3-N采纳GB 7480-87酚二磺酸紫外分
13、光光度法测定；NO2-N测定采纳GB 7493-87 N-乙二胺分光光度法。 2结果与探讨 2.1 好氧反硝化菌的分别鉴定通过BTB培育基初筛后得到6株总氮去除率在45%以上好氧反硝化菌，复筛后得到1株高效反硝化菌脱氮效率高于60%，命名为AD-1。图1为菌株AD-1总基因组电泳图，以基因组为模板，以细菌通用引物进行菌株的16S rDNA扩增，扩增出大小约为1.5kb左右的片段，如图2所示。对扩增得到的16S rDNA片段进行测序分析，测得序列大小为1468bp。通过Genbank数据库进行Blast比对并构建NJ进化树，结果如图3所示，可以看出菌株AD-1与假单胞菌属(Pseudomonas
14、)中的Pseudomonas putida同源性达到101%，所以AD-1初步鉴定为Pseudomonas putida。 2.2 AD-1菌的脱氮性能测定考察AD-1菌株在60h内以NO为唯一氮源的DM培育基中的脱氮效率及CODcr/TN随时间改变状况，脱氮效率以TN去除率计，如图4所示。可以看出AD-1在24h内脱氮效率达到53.2%，48h时达到63.31%，而多数已报道的好氧反硝化菌的脱氮实力在50%左右17,18,19,20。而培育液中的CODcr/TN随时间改变较大。培育初期，CODcr/TN高于60，F/M远远高于微生物生长所需养分，菌体生长代谢旺盛，微生物数量及多种水解酶大量积
15、累；12h后碳源、氮源快速消耗，CODcr/TN渐渐下降，反硝化效率提高缓慢；48h后CODcr/TN降低至5以下，下降率为89.78%，导致微生物生长及代谢产酶实力不足，反硝化效率趋于稳定。所以培育后期CODcr/TN下降是影响AD-1反硝化效率的主要因素之一。 图5考察了NO3-N和NO2-N浓度改变。NO3-N初始浓度为164.005.41mg/L，随着培育时间延长NO3-N去除率渐渐增长，但是受碳源浓度限制，增长率越来越低，48h后去除率达到最高为63.35%。而NO2-N浓度始终保持在较低水平，与多数文献探讨结果一样20,21，但其浓度改变往往被忽视，本探讨发觉NO2-N浓度呈凹凸波
16、动状态，并且振幅越来越小，12h时快速上升至最高值A点而后下降，在48h出现小幅上升至B点的现象。究其缘由可能是由于亚硝酸盐还原酶系的产生须要肯定浓度的亚硝酸盐诱导。当亚硝酸盐浓度较低时，亚硝酸盐还原酶系产生慢于硝酸盐还原酶系；当亚硝酸盐积累到肯定浓度时亚硝酸盐还原酶系被诱导加速分泌，当其还原效率高于硝酸盐还原酶系时，亚硝酸盐浓度削减。亚硝酸盐浓度改变的振幅越来越小是由于后期碳源缺乏，供能不足，导致硝酸盐还原酶系产生削减，亚硝酸盐生成速率下降有关。 2.3 AD-1菌对大豆乳清废水厌氧出水的脱氮效果大豆乳清废水中含有大分子蛋白、小分子寡糖、有机酸、色素类物质和盐类等，而其经厌氧处理后的出水中仍
17、含有较高的COD及肯定量的氮素，厌氧出水中的多种困难成分及酸性条件对微生物生长代谢产生肯定影响。本探讨考察AD-1菌在大豆乳清废水的中的脱氮效率，结果如图6所示。可以看出AD-1菌对大豆乳清废水中NO3-N去除率在24h时达到近101%，废水中的非NO3-N含量基本不变。表明菌株AD-1在大豆乳清废水中具有较好的反硝化特性，但是其硝化功能较差，所以在实际应用中应协同硝化细菌发挥作用，可应用于同步硝化反硝化等处理工艺。 虽然AD-1菌具有较高的反硝化脱氮性能，但是受CODcr/TN及DO等多种关键因素影响，所以为了获得好氧反硝化菌株最优的脱氮条件，须要进一步优化以获得最佳CODcr/TN及DO条
18、件，实现AD-1菌脱氮效率最大化。同时，好氧反硝化菌的硝酸盐还原酶系和亚硝酸盐还原酶系的产酶动力学方向也具有肯定的探讨理论价值。 3结论 3.1 本探讨自CAAC反应器的活性污泥中筛选出1株好氧反硝化菌AD-1，经鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。 3.2 在摇瓶批次培育24h后AD-1对DM反硝化培育基的TN去除率为53.2%，48h后达到63.31%，具有较好的反硝化实力。NO3-N在48h时的去除率达到最高为63.35%，亚硝酸盐浓度虽然始终维持在较低水平却呈有规律的上下波动状态。 3.3 48h后CODcr /TN降低至5以下，下降率为89.78%，是AD-1菌株
19、反硝化脱氮的关键限速因素之一。 3.4 AD-1菌对大豆乳清废水厌氧出水24h内NO3-N去除率达到101%，具有较好的脱氮效果。 参考文献： 1赵冬梅,刘凌,张京健.豆制品生产中高浓度废水的检测与分析J.食品与发酵工业,2022,(01):68-73. 2廖绍安,郑桂丽,王安利等.养虾池好氧反硝化细菌新菌株的分别鉴定及特征J.生态学报,2022,26(11):3738-3734. 3Chneby, D., Philippot, L., Hartmann, A., Hnault, C., and Germon, J. C. 16S rDNA analysis for characterizat
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